miR-20a/b靶向沉默ABCA1对胆固醇逆转运的影响

The ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1) is a major regulator of the process of reverse cholesterol transport. Bioinformatics prediction has become an important method in search for miRNA target genes. Many authoritative bioinformatics website analysis shows that miR-20ai s highly conserved, a high degree of integration with ABCA1. So we propose the following hypothesis that miR-20a can inhibit cholesterol efflux and promote AS, by targeting regulate the expression of ABCA1. In this study, we will adopt luciferase reporter assay to clear whether miR-20a can directly combine with the ABCA1; Overexpression or silencing of THP-1 cell of miR-20a, we intend to observe the expression of ABCA1, lipid droplets, cholesterol efflux and cholesterol ester content;Overexpression or silencing apoE-/- mice of miR-20a,we will detect the expression of ABCA1, HDL, plaque area and the efficiency of reverse cholesterol transport impact.We expect to reveal the molecular mechanisms of miR-20a leading to AS and find a new target for regulation of ABCA1.

ABCA1是胆固醇逆转运的关键蛋白，具有抗As的作用。生物信息学预测成为当今寻找miRNA靶基因的重要方法。多个权威生物信息靶点预测网站分析示：miR-20a高度保守，可与ABCA1结合。我们预实验结果示，miR-20a 对ABCA1 3'UTR中靶点有直接抑制作用。为此，我们提出如下假说："miR-20a可靶向沉默ABCA1表达，抑制胆固醇逆转运，发挥促As作用"。本项目拟采用荧光素酶报告基因分析miR-20a与ABCA1的直接作用；过表达或沉默THP-1细胞miR-20a，观察对细胞ABCA1，脂滴，胆固醇与胆固醇酯含量，胆固醇流出的影响；过表达或沉默apoE-/-鼠miR-20a，观察对ABCA1，HDL，As斑块面积，胆固醇逆转运效率的影响。有望揭示miR-20a致As的分子机制，发现调控ABCA1新靶点，为As防治提供新途径。

本项目主要研究“miR-20a/b靶向沉默ABCA1对胆固醇逆转运的影响”。研究内容分为四部分：1、生物信息学预测miR-20a/b与ABCA1靶向结合。结果显示，miR-20a/b可与ABCA1的mRNA的 3’UTR结合，并且miR-20a/b高度保守，miR-20a/b与ABCA1的mRNA 3’UTR结合自由能较低。2、荧光素酶报告基因实验研究miR-20a/b与ABCA1的靶向结合作用。结果显示，miR-20a/b可降低野生型ABCA1 3’UTR荧光素酶活性；当ABCA1 3’UTR 突变两个序列后，miR-20a/b不能降低ABCA1 3’UTR荧光素酶活性；Con miR不能降低野生型和突变后ABCA1 3’UTR荧光素酶活性。说明miR-20a/b可靶向结合ABCA1的mRNA 3’UTR。3、细胞水平研究miR-20a/b靶向沉默ABCA1的表达及对胆固醇逆转运的影响。结果显示，与对照组相比，miR-20a/b可降低THP-1源性泡沫细胞ABCA1 mRNA和蛋白的表达；miR-20a/b inhibitor 可升高ABCA1 mRNA和蛋白的表达。从而，miR-20a/b降低THP-1源性泡沫细胞的胆固醇流出率，增加细胞内胆固醇含量；miR-20a/b inhibitor升高THP-1源性泡沫细胞的胆固醇流出率，降低细胞内胆固醇含量。4、动物实验研究miR-20a/b靶向沉默ABCA1的表达及对动脉粥样硬化的影响。结果显示，miR-20a/b可加重apoE-/-小鼠的动脉粥样硬化病变，而anti-miR-20a/b 可减轻apoE-/-小鼠的动脉粥样硬化病变；miR-20a/b 可减少apoE-/-小鼠肝脏ABCA1 mRNA和蛋白的表达，而anti-miR-20a/b可增加ABCA1 mRNA和蛋白的表达增加；miR-20a/b 可减少apoE-/-小鼠 HDL的含量，升高LDL，而anti-miR-20a/b可增加HDL的含量，降低LDL含量。总之，miR-20a/b可抑制ABCA1的表达，降低胆固醇流出率，升高细胞内胆固醇，加重动脉粥样硬化。miR-20a/b inhibitor作用与miR20a/b相反。本项目研究成果，发表中文核心期刊1篇，接收SCI 论文1篇，另一篇SCI正整理投稿中。本项目培养博士研究生1名，硕士研究生2名。