MiR-27a/b靶向沉默ABCA1调控胆固醇逆向转运

ABCA1是胆固醇逆向转运的关键蛋白，具有抗动脉粥样硬化（As）的作用。研究发现miR-27a/b促进As的发生发展，但机制未明，我们前期证实miR-27a/b促进巨噬细胞内胆固醇蓄积，并沉默ABCA1表达。为此，我们提出如下科学假说："miR-27a/b通过靶向沉默ABCA1表达，抑制胆固醇流出，发挥促As作用"。本项目拟采用荧光素酶报告基因分析miR-27a/b与ABCA1的直接作用；过表达或沉默THP-1和小鼠腹腔巨噬细胞miR-27a/b，观察对细胞内脂滴、胆固醇与胆固醇酯含量、ABCA1表达水平、胆固醇流出的影响；过表达或沉默apoE-/-鼠miR-27a/b，观察对血脂水平、As斑块面积、ABCA1表达水平、胆固醇逆向转运效率的影响。有望揭示miR-27致As的分子机制，为其作为As的临床标记提供新的实验依据；发现调控ABCA1新的靶点，为As防治提供新的途径。

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）引起的心脑血管疾病严重威胁人类健康，尤其在发展中国家，其发病率正逐年升高，已成为世界首位人口死亡原因之一。研究发现促进胆固醇逆向转运（reverse cholesterol transport，RCT）对AS等心脑血管疾病的防治具有重要意义。三磷酸腺苷结合盒转运体 A1（ATP binding cassette transporter A1）在 RCT 和 HDL 生成的起始步骤中起重要作用，是调节RCT防治AS的关键蛋白。近年来microRNA做为一种微小分子调控多种靶基因表达影响AS的发生发展，成为研究热点。其中miR-27a/b 可调控糖脂代谢、脂肪细胞分化、血管生成和炎症因子表达，可能通过参与调控胆固醇代谢而发挥其促 As 的作用，但机制不明。本项目研究发现：1）生物信息学分析发现miR-27a/b在进化上高度保守，能直接靶向结合ABCA1的3’UTR。2）采用荧光素酶报告基因证实miR-27a/b 与 ABCA1 的3’UTR直接作用，降低ABCA1表达量。3）THP-1 和RAW264.7巨噬细胞内过表达 miR-27a/b后，油红O染色观察到细胞内脂质蓄积水平增加，高效液相色谱法分析发现游离胆固醇与胆固醇酯含量改变，qPCR和Western blot检测ABCA1的mRNA和蛋白水平均降低，液体闪烁计数器研究发现细胞内胆固醇流出水平显著降低；而抑制miR-27a/b后细胞内胆固醇蓄积水平降低，ABCA1表达水平增加，胆固醇流出增多。4）apoE-/-小鼠经高脂饮食或普通饮食喂养12周后，腺病毒转染过表达miR-27a/b，氧化酶法检测血浆甘油三酯和总胆固醇水平不变，HDL水平降低；小鼠主动脉条经油红O染色检测观察到斑块显著增多；小鼠心脏瓣膜切片经HE、masson和油红O染色发现斑块面积显著增大；小鼠肝脏和腹腔巨噬细胞内ABCA1表达水平显著降低；RCT水平显著降低。抑制miR-27a/b后的小鼠ABCA1表达显著增加，AS斑块面积显著降低，其RCT显著增加。本项研究结果揭示了 miR-27a/b 促进 As 和脂质代谢紊乱的作用途径； 阐明了miR-27a/b 靶向沉默 ABCA1，并抑制胆固醇流出的分子机制；为调控 ABCA1 活性、促进RCT和防治AS提供新的干预途径和药物作用靶点。