牛微小隐孢子虫Cp23基因在干酪乳杆菌中嵌合型S-层蛋白活菌表达载体系统的构建

本研究拟采用牛微小隐孢子虫（ Cryptosporidium parvum ）子孢子抗原Cp23基因和乳酸菌S-层蛋白slp基因前导肽以及蛋白酶PrtP基因为材料，通过DNA重组技术，构建嵌合型S-蛋白干酪乳杆菌（Lactobacillus casei Zhang）活菌载体系统：pMG-slp-LEISSTCDA:Cp23:PrtP。经过电转化将其导入宿主菌体内，在该工程菌的体外培养物中，采用Western blotting和IFAT方法检测Cp23基因的表达产物和位置；并鉴定其与哺乳动物肠上皮细胞黏附特性。工程菌通过口服免疫小鼠以后，检测Cp23抗原特异的抗体（如粘膜IgA和血清IgG）、细胞因子（如IL-12和IFN-γ）和T淋巴细胞亚群（如CD4和CD8）变化。经评价工程干酪乳杆菌在小鼠动物模型中所产生的生物学效应，试图为进一步研制预防牛微小隐孢子虫的新型疫苗研究奠定基础。

牛微小隐孢子虫（C. parvum）是以主要危害牛羊的常见人畜共患的原虫病之一。在全世界范围内，目前对该病的防治没有特效药物和疫苗。本项目以干酪乳杆菌为活菌载体，以牛微小隐孢子虫CP23为抗原，成功构建了胞浆型和分泌型活疫苗载体pMG-p23和pMG-USP45-p23；利用乳杆菌S-层蛋白质独特的结构特性，成功构建锚定型活疫苗载体pMG-SLP-p23。并口服给BALB/c小鼠体，在小鼠体内探讨以上活疫苗载体的抗原性和免疫原性，为开发研制能够有效预防牛微小隐孢子虫病的新型疫苗，进行了系统的探索性研究，具体研究内容和结果如下：.1.成功构建和鉴定出乳杆菌细胞内表达的胞浆型活疫苗载体pMG-p23，解决外源基因cp23基因是否在乳杆菌中有效表达以及该表达产物有无抗原性等关键问题。在乳杆菌中cp23基因的表达产物大小约为23kDa，与天然Cp23蛋白质大小是一致，并以1011cfu/100µL的剂量口服BALB/c小鼠后第14d在血清和粪便中分别检测到特异性抗体IgG和IgA，但是总的抗体滴度不高。采集免疫后的BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞，检测细胞因子IL-4、IL-6和IFN-γ，与各类对照组相比较，IL-6和IFN-γ水平提高显著（p＜0.05）。.2.成功构建和鉴定出乳杆菌细胞外分泌表达的分泌型活疫苗载体pMG-USP45-p23，解决外源基因cp23基因是否在乳杆菌中有效分泌以及该分泌表达产物有无抗原性等关键问题。在乳杆菌培养物上清中检测到大小约为23kDa的Cp23蛋白质，并以108cfu/100µL的剂量鼻腔免疫BALB/c小鼠后第14d在血清中分别检测到特异性抗体IgG，但是总的抗体滴度和pMG-p23免疫情况相当，变化不明显。.3.成功构建和鉴定出乳杆菌锚定型活疫苗载体pMG-SLP-p23。在乳杆菌表面洗脱物中检测到大小约为70kDa的Cp23融合蛋白质，并以108cfu/100µL的剂量经鼻腔(口服为1011cfu/100µL)免疫BALB/c小鼠后第14d，分别在血清和粪便中分别检测到特异性抗体IgG和IgA，但是总的抗体水平提高不显著。采集免疫后的BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞，检测细胞因子IL-12和IFN-γ，与各类对照组相比较，IFN-γ水平提高显著（p＜0.05），而IL-12水平变化不明显。