贝氏隐孢子虫转染系统的构建

隐孢子虫病仍无有效药物和疫苗，转染技术是研究隐孢子虫基因功能，筛选药物靶基因和保护性抗原基因最有效的工具之一，目前尚未见隐孢子虫稳定转染的成功报道。贝氏隐孢子虫在实验操作等方面具有独特优势，本研究拟以贝氏隐孢子虫为模型，以黄色或红色荧光蛋白为标记分子构建隐孢子虫转染载体，用电击转染手段在鸡体内建立隐孢子虫转染系统。通过瞬时转染筛选优秀启动子和优化转染方法，提高转染效率，然后采用流式细胞仪和荧光显微镜等技术在鸡体内建立稳定转染系统。用Southern blotting、质粒拯救法和动物感染试验等对转基因隐孢子虫进行基因组分析和表型分析。最后探索转染技术在隐孢子虫基因表达调控研究中的初步应用。该研究结果将有力推动隐孢子虫入侵、代谢等相关基因功能研究，加快抗隐孢子虫药物问世以及拓展以贝氏隐孢子虫为活疫苗载体的研究。

为了构建隐孢子虫的转染技术平台，本研究以贝氏隐孢子虫为模型，通过分子克隆和生物信息学技术成功克隆到了贝氏隐孢子虫的基因H4、H2B启动子和H2B的转录终止调控序列，以及细小隐孢子虫的ACTIN基因的启动子；以双黄色荧光蛋白作为报告基因构建了3个隐孢子虫转染载体。通过REMI(限制性内切酶介导的整合转染)方法将转染质粒导入贝氏隐孢子虫子孢子和卵囊，然后将电击后的子孢子和卵囊分别经直肠和嗉囊接种给10-14日龄的海兰公雏鸡，在接种后7-14天用荧光显微镜检测粪便卵囊和法氏囊隐孢子虫虫体是否表达黄色荧光蛋白。结果显示，2个贝氏隐孢子虫转染载体pCbHEH2、pCbH2EH2，1个细小隐孢子虫转染载体pCpAEH2能成功在贝氏隐孢子虫体内表达黄色荧光蛋白，其中含H4基因编码区起始81bp的转染载体引导黄色荧光蛋白主要在核上表达；而含ACTIN编码区69bp的载体使黄色荧光蛋白在细胞质中表达。但是柔嫩艾美耳球虫转染载体pEtHEA和pEtAEA却不能在贝氏隐孢子虫中表达外源基因。直肠接种电击子孢子和嗉囊接种电击卵囊均是有效的转染接种途径，但是前者转染效率更高。通过纯化卵囊和流式细胞分选技术筛选发光隐孢子虫卵囊，然后再反复接种雏鸡扩增4代，成功获得稳定表达黄色荧光蛋白的转基因隐孢子虫卵囊（pCbHEH2）。基因组分析发现，转染质粒随机整合在贝氏隐孢子虫的基因组中。本研究成功建立了贝氏隐孢子虫的转染系统，为隐孢子虫入侵、代谢等相关基因功能研究和以隐孢子虫为活疫苗载体的研究提供有效的工具。另外，我们还对洛阳地区鸡源隐孢子虫感染情况进行了调查分析，获得了重要的研究材料—贝氏隐孢子虫洛阳分离株LY；系统研究了不同接种途径对贝氏隐孢子虫寄生部位的影响；对猪源肉孢子虫当前流行情况及其公共卫生风险性进行了初步研究。