荧光假单胞菌沉默基因簇的激活表达及其合成产物活性研究

Rhizobacterium Pseudomonas fluorescens can produce a variety of secondary metabolites with the capacity to suppress a number of soil-borne or residue-borne fungal pathogens and has been widely used in plant disease control.By analyzing the genomic sequence of Pf-5 strain,two silent gene clusters were identified.Although silent gene clusters are not expressed or expressed at very low levels in laboratory conditions, they could be activated by natural environmental factors and their synthetic products often play an important role in its producing strain.In order to reveal the role of products synthesized by these two silent gene clusters, four kinds of methods,including heterologous expression, replacement of original promoters,regulation expression of transcription factors and co-cultivation with other rhizobacteria, will be used to awaken the expression of silent gene clusters. Liquid chromatography-mass spectrometry and NMR techniques will be used to elucidate their structures.Products will be purifed by HPLC and their biological activities will also be studied.This study will lead to a more comprehensive understanding of disease control mechanism and survival mechanism in the rhizosphere environment of Pseudomonas fluorescens,which will lead to make better use of Pseudomonas fluorescens to control plant disease.In addition,a rapid gene cluster cloning and heterologous expression system will also be developed,which will speed up studies of secondary metabolites.

根际细菌荧光假单胞菌能产生多种具有抑制植物病原菌活性的次级代谢产物，被广泛应用于植物病害防治。分析Pf-5菌株基因组序列发现，其基因组中存在2个沉默基因簇。虽然沉默基因簇在实验室条件下不表达或表达量很低，但是在自然环境中它们被诱导表达，其合成产物往往具有十分重要的功能。为了揭示Pf-5菌株中沉默基因簇合成产物在植物病害防治中的作用，本研究拟采用异源表达、替换启动子、调控表达转录调控因子、与根际微生物共培养4种方法，激活Pf-5菌株中沉默基因簇的表达，合成新型次级代谢产物；利用液相色谱-质谱联用和核磁共振技术解析产物结构；利用高效液相色谱纯化产物，并研究它们的生物活性及在Pf-5菌株中的生理功能。本研究将更全面的掌握荧光假单胞菌的防病机制及其在根际环境的生存机理，有利于更好的利用该细菌进行植物病害防治。本研究还将建立一套基因簇快速克隆和异源表达的方法体系，加快次级代谢产物研究进程。

根际细菌荧光假单胞菌能产生多种具有抑制植物病原菌活性的次级代谢产物，被广泛应用于植物病害防治。课题组分析Pf-5 菌株基因组序列发现，其基因组中存在2 个沉默基因簇。虽然沉默基因簇在实验室条件下不表达或表达量很低，但是在自然环境中它们被诱导表达，其合成产物往往具有十分重要的功能。为了揭示Pf-5 菌株中沉默基因簇合成产物在植物病害防治中的作用，本研究按原定计划,采用了异源表达、替换启动子、调控表达转录调控因子、与根际微生物共培养4 种方法，对Pf-5 菌株中沉默基因簇进行了激活研究。此外，在研究过程中，课题组还利用核糖体工程技术对Pf-5 菌株进行了改造，以期激话沉默基因簇的表达，获得新型化合物，同时达到提高菌株中其它代谢产物产量的目的。. 通过本项目的研究，（1）发明了“Cre/loxP+BAC复制子”策略，成功克隆了Pf-5 菌株中的沉默基因簇，建立了一套新型的利用位点特异重组酶Cre/loxP系统和BAC复制子的大片段DNA克隆新技术。（2）在Pf-5菌株中建立了快捷、高效的基因组修饰系统。（3）将克隆的Pf-5基因簇进行了异源表达研究，利用建立的重组系统，进行了基因簇的启动子替换和转录调控因子的修饰实验，同时也进行了Pf-5与其它根际微生物共培养实验，但是在异源宿主中未能检测到新型的化合物。（4）利用核糖体工程技术获得了利福平抗性突变菌株，菌株中有四种次级代谢产物的产量显著增加，其中三种为已知化合物，另外一种化合物的结构和活性还有待进一步鉴定。本研究首次在革兰氏阴性细菌中利用核糖体工程技术进行菌株选育，同时也为荧光假单胞菌菌株选育和遗传改良提供了研究基础。（5）本研究建立的基因簇快速克隆方法“Cre/loxP+BAC复制子”被成功运用到发光杆菌和根癌农杆菌中，分别克隆了III型分泌系统基因簇和嗜铁素生物合成基因簇，展示了该策略的应用广泛性。