Sox2维持小鼠切牙上皮干细胞启动切牙发育的分子机制研究

Sox2 plays important roles in the maintenance of many stem cells. The mouse incisor can grow throughout life, which provides an ideal model to study stem cell biology. Our previous study find that Sox2 expresses highly in the incisor epithelium. But when we knock out Sox2 gene in the dental epithelium at E11.75 after incisor initiation using K14-cre，Sox2fl/fl mice, the mutant mice still formed the erupted incisor with typical labial cervical loop. We speculate that before Sox2 is deleted, it can maintain the incisor epithelium stem cell and activates its downstream genes and signaling pathways to initiate the incisor initiation. So this project aims to knockout the Sox2 gene in the dental epithelium before the incisor initiation (E10.5) using Pitx2-cre，Sox2fl/fl conditional knockout mice ,which may have no initiation of incisor germs. And the cDNA microarray technique will be used to detect the differentially expressed genes in the dental epithelium of Pitx2-cre，Sox2fl/fl mice, K14-cre，Sox2fl/fl mice and the wild type mice. Bioinformatics will be used to find the target genes of Sox2 and find their binding sites. Finally, we will try to rescue the incisor initiation by inhibition or activation of the target genes.

Sox2对维持多种干细胞起重要作用。小鼠切牙能终生生长，为干细胞研究提供了理想模型。本项目申请人前期研究发现Sox2高度表达于切牙上皮结构。但是通过构建K14-cre，Sox2 fl/fl敲除鼠，于切牙发育起始之后（E11.75），在牙上皮敲除Sox2，却未发现切牙发育异常。由此推测在Sox2被敲除前，Sox2基因能够维持切牙上皮干细胞，并通过激活下游靶基因及相关信号通路从而启动并维持切牙发育。因此，本项目旨在通过构建Pitx2-cre，Sox2fl/fl 鼠，于牙胚起始发生之前（E10.5），将Sox2在上皮敲除，预测切牙将不能起始发生；进一步利用基因芯片检测Pitx2-cre，Sox2 fl/fl 鼠、K14-cre，Sox2fl/fl鼠与野生鼠的差异表达基因，结合生物信息学筛选Sox2下游靶基因，并明确其作用位点；最后过表达或抑制表达下游靶基因，体外挽救切牙的发生。

Sox2对维持多种干细胞起重要作用。通过构建Shh-cre,Sox2fl/fl 小鼠，将Sox2于牙发生之前（E10.5）在牙上皮敲除，发现小鼠下颌切牙能够于E11.5天起始发生，经历蕾状期E13.5，帽状期E14.5,钟状期E15.5-E17.5，形成唇舌侧颈环结构，但是发育至E18.5 切牙发育开始退化，唇侧典型颈环结构开始消失，唇侧成釉细胞分化障碍，舌侧成釉细胞异位分化并形成牙釉质基质。基因芯片结果显示有10个基因上调，14个基因下调。筛选shh为下游基因，参与调控成釉细胞的分化。该实验结果进一步阐明了Sox2调控牙上皮干细胞向成釉细胞分化的调控机制。为未来牙再生的实现提供理论依据。.此外，该条件敲除小鼠具有腭裂，舌发育异常，舌体前部与下颌骨粘连。通过体外腭器官培养，排除了舌发育异常为产生腭裂原因；通过EDU增殖实验发现，在E14.5，非上抬侧腭板上皮细胞增殖显著下降，而间充质细胞增殖能力未受明显影响；实时荧光定量分析结果发现，在E14.5天时，Bmp4在突变型小鼠的未上抬腭突中的表达明显下调，而在上抬侧腭突中的表达显著上调。然而， Msx1基因的表达水平在突变型小鼠的两侧腭突中都显著上调。其他的信号分子和转录因子，如Fgf10、Shh、Osr2、Pax9和Fgf8在两侧腭突中都显著地下调趋势，并且未上抬侧腭突比上抬侧腭突下调更明显。P<0.05，差距具有统计学差异。该实验结果，初步阐明了Sox2在腭发育中的功能，为腭裂的防治提供理论依据。