基于电化学-质谱在线活性联用的复方丹参制剂仿生代谢技术的研究

The study of metabolic compounds of traditional Chinese medicine (TCM) has been a hotspot and difficulty of TCM research. In order to overcome the shortcomings of the metabolism of TCM, a novel strategy for simulated metabolism of TCM with online activity-integrated electrochemistry/mass spectrometry was developed. According to the complexity and compatibility of TCM ingredients, the phase I metabolism of compound Danshen preparations in the liver was studied by the means of instantaneous simulation of biotransformation of cytochromes P450 enzymes in the electrochemical flow cell. The adducts of compound Danshen preparations were formed by adding a protein such as glutathione after electrochemical flow cell, namely phase II metabolism study. Furthermore, the biological metabolites and mechanism of active compounds of TCM were analyzed through the detection of high resolution mass spectrometry. The system is rapid, high efficiency, low cost and sensitive without matrix interference, and applied to complex natural products based on the advantage of biological simulation and compatibility of TCM. The study of the project provides new research method for the rapid identification of TCM metabolites, and is beneficial to new drugs of TCM. Additionally, the method has important scientific significance and application value.

中药代谢成分的研究，一直是中药研究的热点和难点课题。本项目针对当前中药代谢研究方法的不足，拟建立一种独特的基于电化学-质谱在线活性联用的中药仿生代谢研究新体系。我们结合中药成分复杂及配伍的特点，在电化学流通池中瞬间模拟酶生物转化的细胞色素P450反应，研究复方丹参制剂发生在肝脏的I相代谢反应。并通过在电化学流通池后添加谷胱甘肽等蛋白, 模拟丹参组方加合物的形成，即II相代谢研究，经在线高分辨质谱检测，解析中药活性成分的生物代谢产物及作用机制。该研究体系从生物模拟、中药配伍角度出发，具有快速、高效、低成本、灵敏、无基质干扰，适用于复杂体系的特点。本项目的研究为快速鉴定中药代谢产物提供全新的研究思路与方法，有益于中药新药创制，具有重要的科学意义和应用价值。

制备了一种环境友好的水包离子液体（IL/W）的微乳液，作为微乳液相色谱（MELC）的流动相，配备紫外检测器和电化学检测器（ECD），用于分析实际样品中的酚类化合物。该方法的最佳条件为：微乳液的最佳组成（0.2% w/v [HMIM]PF6，1.0% w/v十二烷基硫酸钠，3.0% w/v正丁醇，95.8% v/v水，pH 2.5），紫外检测。验证结果表明，该方法具有较高的灵敏度、精密度和准确度，低的检出限在17.9-238 ng/mL之间，平均回收率在80.1-105%之间，线性范围良好（r2>0.9994）。此外，与传统的MELC方法相比，该方法对分析物具有较高的选择性和分离度，且更环保。结果表明，所建立的IL/W-MELC方法可以同时分离和测定丹参样品及其制剂中的目标化合物。本项目采用电化学-四极杆-飞行时间串联质谱（EC/Q-TOF/MS）方法，研究了丹参样品中五种酚酸的氧化转化和代谢途径。在装有玻璃碳工作电极的电化学反应器中进行了Ⅰ相氧化代谢的模拟实验。通过共价加合物形成实验的方法研究了生成的氧化产物对生物分子（如谷胱甘肽）的II相代谢活性。将EC/MS法所得结果与大鼠肝微粒体体外孵育的结果进行了比较。电化学产生的代谢物的结构通过精确的质量测量和先前在体内鉴定的结果来确证。结果表明，电化学氧化的结果和在体内实验中发现的类似代谢产物相一致。总之，这项工作证实了EC/Q-TOF/MS可以作为预测传统中药代谢转化的强有力分析工具。