基于二维生物微反应器的丹参药对及其组方多靶标活性筛选研究

Chromatographic methods for the study of active ingredients of traditional Chinese medicine (TCM) have been a hotspot and difficulty of TCM research. In order to overcome the shortcomings of screening of active ingredients of TCM, a novel strategy for multi-target activity screening using two-dimensional biological microreactor was developed. The two-dimensional biological microreactor was prepared using thrombin and angiotensin converting enzyme as target enzyme and Danshen drug drug pair and Fufang as the research object in three steps: first, the herb extract and target enzyme were incubated in one-dimensional biological microreactor created by immobilized magnetic beads; subsequently, the incubation solution injected into another dimension of enzyme microreactor created by molecular self-assembly technique and incubated; third, the structure of active ingredients was identified by mass spectrometry for the activity screening of TCM extracts after the complex was on line enriched, and the product and substrate were separated. The screening system is rapid, high efficiency, low cost and sensitive, and applied to complex natural products based on multi-target screening, highly targeted enzyme reaction, high sensitivity of the compounds, the advantage of qualitative information and generality on mass spectrometry detector. The developed method is expected to be used in TCM for the screening the leading compounds with thrombin and angiotensin converting enzyme, and it is more important that it provides new research methods for the screening of active ingredients of TCM.

中药活性成分的色谱方法学研究，一直是中药研究的热点和难点课题。本项目针对当前中药活性成分筛选研究模式的不足，拟建立一种独特的基于二维生物微反应器的色谱多靶标活性筛选新体系。二维生物微反应器选择凝血酶、血管紧张素转化酶为靶标酶，以丹参药对及其组方等中药为研究对象，将中药提取物与靶标酶在磁珠固定化的一维生物微反应器中经孵育后，进入另一维的分子自组装的酶微反应器中，反应后，复合物经色谱在线富集、产物、底物分离后，质谱系统给出活性成分的结构鉴定信息，对中药提取物进行活性筛选。该筛选体系集多靶标筛选、酶反应高度靶向性、化合物的高灵敏度、质谱检测器定性信息及通用性的优势于一体，具有快速、高效、低成本、灵敏、适用于复杂体系的特点，它的建立与成功应用，不仅有望从常用中药中同时筛选出具有凝血酶和血管紧张素转化酶抑制活性的先导化合物，更重要的是为中药活性成分筛选提供新的研究思路与方法。

本项目针对当前中药活性成分筛选研究模式的不足，建立了一种独特的基于生物微反应器的色谱靶标活性筛选新体系。采用直接共价键合的方法把凝血酶固定在M-270型环氧树脂磁珠上。酶固定化磁珠与超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱技术相结合，建立了一种简单、快速、可靠的方法，用于丹参制剂中凝血酶抑制剂的筛选。扫描电子显微镜、透射电子显微镜和红外光谱用于凝血酶修饰的磁珠表征特征研究，并通过酶-磁珠结合率和靶化合物的峰面积分析确定靶标酶的活性。在凝血酶抑制剂筛选实验过程中，优化了磁珠用量、洗脱溶剂种类、孵育温度和时间这些关键参数。此外，从丹参注射液中筛选出了两种凝血酶抑制剂-原儿茶醛和丹酚酸C，并且测定了它们的半抑制浓度（IC 50），分别为 286.11 和66.09 μg/mL。研究结果表明，这种凝血酶抑制剂筛选方法可以有效地从药用植物中筛选靶标酶活性化合物。使用表面活性剂包裹的石墨化多壁碳纳米管（SC-GMWNTs）作为CE中的新型伪固定相，用二极管阵列检测器测定丹参和尿液样品中的酚酸和丹参酮。在最佳条件下，该方法显示出良好的线性，相关系数高于0.9950。LOD的范围为0.71-3.10 μg/ mL。在分散固相微萃取中使用介孔杂化材料（MHM），从植物茶中萃取丹参酮化合物，然后通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱分析该二萜醌类化合物。在实际样品测定中，丹参茶回收率为91-103％，丹参药材为89-102％，丹参酮胶囊为88-96％。结果表明，所建立的方法适用于提取和测定复杂丹参样品中的丹参酮化合物。建立了一项新型的分散微固相萃取技术，采用氧化石墨烯作为吸附剂，液相色谱-质谱测定丹参及其制剂中的酚酸类成分，考察了样品混合方式、混合时间、吸附剂用量、洗脱液种类和体积等提取参数。在最优的条件下，获得了好的检测限（0.07-0.21 ng/mL）和提取重复性 (RSDs< 5.6 %, n=5)。它的建立与成功应用，不仅从常用中药中筛选出酶活性的先导化合物，更重要的是为中药活性成分的筛选和提取提供新的研究思路与方法。