红花脂肪酸积累规律及其ω6和ω3脂肪酸脱氢酶基因调控研究

Safflower has a good reputation of "king of linoleic acid". Commonly, the contents of linoleic acid in safflower is more than 75%. Safflower has the function of lowering cholesterol, stabling blood pressure and promoting micro-circulation. Then the safflower with high oleic acid were also discovered. ω6 and ω3 fatty acid desaturase genes are the key genes synthetize linoleic acid and Linolenic acid. Our project intends to isolate ω6 and ω3 fatty acid desaturase genes from safflower using molecular biology and bioinformatics technology and verify the function of these genes by eukaryotic expression system, explore its independent and Coordination effects. To study the relationships of fatty acid desaturase genes and the content of the fatty acids, Q-PCR and Western-blot methods will be used to detect transcription and translation of the target genes，GC / MS method will be used to evaluate the compositions of fatty acids. By means of importing exogenous FAD3 gene in to safflower, and expecively expressed in seed to verify the deduction of the accumulation mechanism of safflower fatty acid. In addition, the influence of target genes on the metabolic regulation mechanisms of safflower fatty acid under low temperature will be analyzed at transcriptional and post-transcriptional level. This study has great significance to enrich and improve the plant fatty acid regulatory pathways. It will also provide scientific basis and lay the fundation of safflower fatty acids metabolism by artificial regulation.

红花素有"亚油酸之王"之美誉,籽油中亚油酸含量可达75% 以上, 具降低胆固醇、稳定血压等功效，后也发现高油酸类型红花。ω6和ω3脂肪酸脱氢酶基因是亚油酸和亚麻酸合成关键酶基因。本项目拟用分子生物学手段克隆红花ω6和ω3脂肪酸脱氢酶基因，对其功能进行验证，探讨其独立和协同作用；拟采用定量Q-PCR和Western-blot方法检测不同类型红花资源材料种子中上述目的基因转录和翻译水平，并用气质联用（GC/MS）法分别检测其对应种子脂肪酸组成及含量，探讨上述目的基因转录表达与红花种子脂肪酸积累间关系；还将采用外源ω-3脂肪酸脱氢酶基因FAD3导入红花种子特异表达的方法，对红花种子脂肪酸形成机制进一步验证；并将从ω6和ω3脂肪酸脱氢酶基因的转录和翻译水平上探讨低温对红花不同组织脂肪酸代谢调控的影响。该研究对丰富和完善植物脂肪酸调控途径有十分重要意义，将为实现红花脂肪酸代谢人工调控提供科学依据。

红花素有“亚油酸之王”之美誉，红花种子可根据脂肪酸组成及含量分为高、中、低亚油酸类型，ω6和ω3脂肪酸脱氢酶基因是亚油酸和亚麻酸合成关键酶基因。本项目基于红花转录组测序RNA-seq以及荧光定量PCR 技术，共发现红花存在12-14个FAD2基因拷贝，为已检测到的所有植物中FAD2基因拷贝数最多的。共克隆出8个FAD2和1个FAD6基因全序列，还克隆到2个质体类（CtFAD7和CtFAD8)和1个微体类(CtFAD3)ω-3脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA。经酵母表达发现，CtFAD2-1，2，6，8具油酸脱氢酶活性。普通型红花种子中，CtFAD2-1是最主要的油酸脱氢酶基因；红花叶片中存在高表达的CtFAD7和CtFAD8，可形成大量的亚麻酸；而其种子中不存在亚麻酸，则主要由CtFAD3基因在种子中基本不表达和翻译所致。基于转录组数据，还筛选出了稳定性较好的红花内参基因组合60SRPL10+EF1和60SRPL10+EIF5A。不同类型红花材料种子脂肪酸累积模式和其脂肪酸生物合成途径关键酶基因表达模式不尽相同。低亚油酸材料种子中的CtFAD2-1在+603 bp处有胞嘧啶碱基(C)的缺失，引起阅读框移码突变，导致该基因翻译提前终止，缺失了第三个与酶活性中心密切相关的组氨酸保守区，酵母表达也证实了该突变导致失去油酸脱氢酶基因功能；CtFAD2-2，CtFAD2-3基因序列在各种类型材料中完全一致；所有材料CtFAD2-4基因序列仅第30位碱基有一个突变位点，但氨基酸序列完全一致；CtFAD2-6、CtFAD2-8均存在两种单倍型，但其在不同类型红花材料间无显著区分，且3个保守的组氨酸基序（HXXGHH, HXXXXXHXXHH和HXXHH）并未因材料不同而改变，蛋白质三级结构也表明其组氨酸保守区的活性中心无显著差异，据此CtFAD2-1是引起红花种子脂肪酸类型区分的主要基因。总体上，苗期低温对红花叶片脂肪酸含量和组成影响较大，对根、茎影响相对较小。蕾期低温下，红花种子脂肪酸含量变化与CtFAD2-1和CtSAD表达量变化存在相关性，但不同类型红花种子中各脂肪酸代谢途径相关基因对低温的响应存在明显差异。该项目比较系统全面地研究了红花脂肪酸累积规律以及ω6和ω3脂肪酸脱氢酶基因调控机制，可为红花脂肪酸人工调控提供科学依据。