酿酒酵母Hsp90-Cpr7-Cns1折叠复合物组装及功能调控机制的结构生物学基础

The proper folding is the physical basic for protein function. Hsp90 (heat shock protein of 90 kDa) is a ubiquitous molecular chaperone in eukaryotes, required for the maturation and stability of hundreds of diverse client proteins. The versatility of Hsp90 can be attributed to the variety of co-chaperone proteins that modulate the role of Hsp90 in many cellular processes. However, it remains largely unknown how co-chaperones interact with Hsp90 or how they interact with clients. Hsp90-Cpr7-Cns1 is one of ternary folding complex constituted by Hsp90 and its co-chaperones from saccharomyces cerevisiae. In this project, we plan to solve the 3D structure of the folding complex Hsp90-Cpr7-Cns1 and illuminate the mechanism of how the ternary complex assembly and how it facilitates the folding of the clients. We also plan to reveal the structural basis of the functional difference between the homologous co-chaperones Cpr6 and Cpr7.

蛋白质的正确折叠是其正确行使生理功能的基本物质保障，热休克蛋白90（Hsp90）负责了细胞中大量未成熟蛋白及不稳定蛋白质的折叠工作。多年来，对Hsp90折叠系统的研究虽已积累了很多发现，但其协助顾客蛋白完成折叠的分子机理至今仍不清楚。Hsp90通过与多种不同辅分子伴侣形成折叠复合物，实现针对不同顾客蛋白的折叠功能，酿酒酵母Hsp90-Cpr7-Cns1折叠复合物就是其中之一。在本项目中，申请人拟综合运用结构生物学、生物化学和细胞生物学技术手段，阐明Hsp90-Cpr7-Cns1折叠复合物的组装机制及其协助顾客蛋白完成折叠的分子机制；我们还希望通过结构-功能关系比较揭示高度同源的Cpr6和Cpr7两种辅分子伴侣之间功能差异的结构生物学基础。同时，鉴于人源Hsp90折叠复合物的相关研究工作相对滞后，上述工作的开展将为深入理解人类Hsp90重折叠组装系统的分子机制提供重要参考。

我们综合运用结构生物学、生物化学及细胞生物学技术手段，尝试阐明Hsp90-Cpr7-Cns1折叠复合物的组装机制及该复合物形成对Hsp90二聚体结构和功能的影响，揭示该复合物协助顾客蛋白完成折叠组装的分子机制。但是，通过体外实验验证，我们发现Cns1、Cpr7和Hsp90虽然存在于同一个大复合物中，但两两之间的相互作用较弱，无法形成稳固的复合物并获得晶体。因此推测存在其它蛋白介导了Cns1、Cpr7和Hsp90之间的相互作用。Hsp90 蛋白和Cpr7 及Cns1 的体外Pull-down实验未能得到完整复合物，关键辅助因子的缺失造成了Hsp90-Cpr7-Cns1折叠复合物无法顺利组装。针对上述难点，我们搭建了基于噬菌体表面展示技术的抗体筛选平台，抗体容量达到1010，通过该平台尝试筛选能特异性结合Hsp90-Cpr7-Cns1折叠复合物及Cpr6 蛋白的高特异性Fab抗体及Nanobody抗体，但最终仍然没能通过抗体结合获得三元复合物，也未能稳定Cpr6蛋白质构象，提高Cpr6 蛋白晶体衍射分辨率。在原有计划任务陷入困境的同时，我们及时拓展了对其他分子伴侣复合物的结构与功能关系研究，先后完成了新月柄杆菌β滑动钳蛋白与分子伴侣结合机制、金黄色葡萄球菌HptRSA传感器复合物的胞内-胞外信号转导结构机制等研究任务。发表标注项目资助的SCI论文6篇，培养了4名优秀的结构生物学后备人才，较好的完成了课题计划任务目标。