酿酒酵母自组装复合功能嵌合纤维小体及其催化调控研究

Self-surface assembly of cellulosome chimeras on Saccharomyces cerevisiae for cellulosic ethanol production has become a research focus in the world. In this study, we demonstrated the functional display of two miniscaffoldins on the yeast cell surface consisting of five divergent cohesin domains. Cellulases including endoglucanases, cellobiohydrolases, glucosidases and hemicellulases including endoxylanase, Xylosidase were displayed on the cell surface of the diploid yeast strain Saccharomyce cerevisiae Y5 by using an optimized a-agglutinin surface display system. Immunofluorescence microscopy, flow cytometric analysis (FACS), and western blotting confirmed the successful display of such multienzyme complex on the yeast surface. Next, substrate channeling of the cellulosome chimeras was investigated by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay. Enzyme-enzyme synergy, enzyme-proximity synergy, and cellulose-enzyme-cell synergy were analyzed, and the catalytic reaction of chimeric cellulosome ex vivo was optimized.

近年来，利用酿酒酵母胞外自组装嵌合纤维小体已成为国内外的研究热点，但与天然纤维小体相比，人造纤维小体普遍存在着酶组分单一、纤维小体的表达活性低、体外组装效率低等问题。为了提高酶和支架蛋白的表达能力以及优化微型纤维小体人工设计，本项目以共代谢葡萄糖、木糖的二倍体重组酿酒酵母Y5作为宿主菌，利用组成型强启动子PGK控制下的a-凝集素展示系统，构建适用于纤维素和半纤维素水解的自组装双支架纤维小体嵌合体，获得具有全细胞催化功能的酿酒酵母多细胞协同反应体系。通过免疫荧光技术、流式细胞术以及蛋白质印迹法验证纤维小体的正确组装，并通过双分子荧光互补（BiFC）技术对其支架蛋白上“酶-酶”邻近协同作用、纤维小体结构对“酶-底物”的影响效应等进行深入研究。研究结果将揭示嵌合纤维小体多酶复合物的底物通道作用机制，为优化调控自组装嵌合纤维小体的胞外催化反应，实现纤维素乙醇生物统合加工提供理论依据。

本研究基于优化设计复杂结构嵌合纤维小体多酶复合物以及提高酿酒酵母生物统合加工反应体系性能的目标，通过将不同类型的支架蛋白功能元件进行特异性杂合组装，首次构建出在三个二级支架蛋白上同时装配有三种纤维素酶和两种半纤维素酶的复合功能嵌合纤维小体CBP反应体系，并对其同步糖化发酵汽爆预处理玉米秸秆的酶解动力学特征和乙醇发酵性能进行了探究。结果表明：工程菌株在30C，90rpm反应96小时所获得的最大乙醇浓度达到0.92g/l，相当于理论产率的53.44%。此外，嵌合纤维小体自组装特性及其所促发的“酶-酶”邻近协同效应和“酶-底物-细胞”复合效应也通过等温滴定量热法进行了验证分析。二级支架蛋白在复合嵌合纤维小体中扮演了类似“固体支持物”的角色，不仅能够提供更多的催化单元结合位点、增加酶的种类和数量，而且可以产生一定的邻近、协同和集成效应，进而提高复合酶系的催化活性。本研究成果对于推进以生物统合加工-酿酒酵母为底盘细胞的生物质能源以及生物基平台化合物的制备和应用具有积极的理论和实践意义。