酿酒酵母RAVE-V1复合物的结构与功能研究

液泡ATP酶（V-ATPase）是一种广泛分布于真核生物中的多亚基跨膜质子泵。它由一个可溶性的V1结构域和一个膜内的V0结构域组成。V1水解ATP产生的自由能被用来实现V0的质子跨膜转运。酵母V-ATPase能够可逆地解离和组装。我们在前期的工作中解析了酿酒酵母的V1和完整V-ATPase的三维电镜结构，确定了V-ATPase中各亚基的空间分布。酵母RAVE复合物由Rav1、Rav2和Skp1等3个亚基构成，它在酵母V-ATPase的稳定组装过程中是必需的。RAVE通过亚基EG与V1结合，并在C亚基与V1的组装过程中起关键作用。本项目将综合运用分子生物学、生物化学和分子电镜学等方法，解析酵母RAVE-V1复合物的三维电镜结构、研究RAVE复合物中3个亚基的空间分布以及RAVE与V1的相互作用。研究结果将从结构生物学的角度，为阐明酵母V-ATPase的可逆组装和活性调控机理提供理论基础。

本项目开展了对RAVE，这一V-ATPase活性调节过程中发挥重要作用的蛋白质复合物的研究。主要研究结果包括：RAVE复合物的3个亚基Skp1p、Rav1p和Rav2p的原核表达；Rav2p和Skp1p的共表达；酿酒酵母细胞中Rav1-Flag的构建、表达和纯化；酿酒酵母细胞中Rav2-Flag的构建、表达和纯化；酿酒酵母RAVE-V1复合物的制备；酿酒酵母RAVE-V1复合物的成分分析。首次发现Leu1p和RAVE形成复合物。这些结果为RAVE复合物的结构和功能的进一步研究提供了基础。