脑皮层RORB的非自主转录调控机制

To date, regulatory mechanisms of gene expression in neocortex are largely known to be cell autonomous. However, we found expression of RORB in layer IV neurons of neocortex depends on thalamocortical axon innervation. Our preliminary experiments showed that the non-autonomous regulation of RORB gene expression is not mediated by neurotransmitter release at thalamocortical synapses nor neurotrophic factors released by thalamocortical axon terminals. In this project, we are going to identify the non-autonomous transsynaptic regulatory mechanism of RORB expression in neocortex. We will employ yeast one-hybrid system to identify thalamus regulatory factors binding to cis regulatory element of RORB gene. The cis regulatory elements of RORB gene will be used as baits to screen cDNA library from thalamus neurons. Positive binding proteins will be subjected for luciferase assays and ChIP sequencing to verify their DNA binding sites. To validate transsynaptic function of the identified trascription factors, we will employ neuronal double culture method and generate thalamus specific transgenic mice of fluorescence or antigen labeled the factors. This project will identify potential transsynaptic molecules that regulate RORB gene expression in neocortex and reveal a novel molecular mechanism of cortical plasticity. Moreover, our study will provide a new molecular tool to study complex neuronal circuits in the brain.

现今所了解的皮层基因表达多为来自神经元本身的自主调控， 我们最新研究发现RORB的表达主要依赖来自丘脑上行轴突的直接突触联系，这种非自主转录调控不是通过突触释放神经递质产生的电活动引起的， 也不由丘脑神经元释放的神经营养因子介导引起。为揭示RORB的非自主跨突触转录调控机制， 我们将采用yeast one-hybrid system 的方法， 以RORB基因的转录调控序列作为bait, 重点扫描丘脑cDNA文库。 扫描得到的阳性转录因子将进行Luciferase Assay 及ChIP sequencing 以确定他们具体DNA结合位点。为证实非自主调控因子的跨突触功能，我们将运用新型细胞隔层培养的研究方法及产生荧光或抗原标记丘脑特异性转基因小鼠模型进行验证。该项目将揭示及分离前所未有的丘脑及皮层之间的跨突触转录调控因子及可塑性的新分子机制，并为开发研究神经环路提供潜在的分子工具。

转录因子RORB（Retinoid-Related Orphan Receptor-Beta）在体感觉皮层发育过程中起重要作用，缺失即导致丘脑皮层突触发育异常和感觉皮层图谱成熟受阻。RORB在皮层的的表达不仅受突触电活动的影响，也受上行纤维的存在影响，这种非自主转录调控的机制研究仍在进行中。在研究过程中， 我们意外发现AKAP5 (A-Kinase Anchoring Protein 5) 在体感觉皮层受RORB的调控。AKAP5是一种参与PKA和PKC激酶功能的重要调节蛋白，它能够直接结合PKA调控亚单位II-beta和PKC。AKAP5 主要在脑皮层表达，在小鼠体感觉皮层表达最高，集中在突触后膜，作为结构嫁接蛋白直接将PKA和PKC固定在突触后膜，可能直接介导丘脑至皮层突触可塑性的主要信使蛋白。 研究该蛋白在丘脑皮层突触发育的功能可以揭示RORB的跨突触转录调控对皮层发育的影响。我们运用cre-loxp 条件性敲除系统成功产生了皮层特异性AKAP5敲除小鼠，详细研究了在缺乏AKAP5的情况下，丘脑至皮层突触的形成与成熟以及体感觉皮层图谱的形成是否发生障碍。我们发现AKAP5是皮层功能发育成熟的关键介导蛋白。