鞘氨醇杆菌JZ-1降解氯氰菊酯的代谢途径分析及菊酯水解酶PytH结构与功能的初步研究

菊酯类农药作为高毒高残留有机磷和有机氯农药的替代品，得到了广泛的应用；但该类农药残留造成生态环境破坏及危害人体健康。微生物降解是消除此类农药残留的有效途径，但目前菊酯类农药微生物降解的研究不够深入和系统，完整的降解代谢途径及参与的酶和基因尚不清楚。.鞘氨醇杆菌JZ-1是本实验室分离的一株广谱菊酯类农药降解菌株，能完全降解氯氰菊酯；本项目拟通过底物利用、相关酶系诱导和降解代谢产物鉴定分析菌株JZ-1对氯氰菊酯的降解途径，利用分子生物学技术获得鞘氨醇杆菌JZ-1降解氯氰菊酯代谢途径中的各个基因，异源表达验证各个基因的功能；并研究该途径关键酶菊酯水解酶PytH的酶学特性，通过随机突变和定点突变获得菊酯水解酶PytH的突变体，发现PytH的关键活性位点；在基因和酶水平上阐明菊酯微生物降解代谢途径，为菊酯微生物降解和调控机制的深入研究及应用提供科学依据。

1.1本项目研究背景和主要内容.目前菊酯类农药微生物降解方面的研究整体上还不够深入、不够系统；菊酯类农药完整的降解代谢途径及参与的酶和基因尚不清楚，降解关键酶菊酯水解酶的结构与功能及催化机制亟待深入研究。Sphingobium sp. JZ-1是本实验室分离到的一株广谱菊酯类农药降解菌株。本项目确定菌株JZ-1对氯氰菊酯的降解途径，获得Sphingobium sp. JZ-1降解氯氰菊酯代谢途径中的各个基因，最终从基因和酶学水平上阐明菊酯微生物降解代谢途径，为菊酯残留污染环境微生物修复提供理论基础。.1.2本项目取得的重要成果.（1）分离获得菊酯降解多株，其中5个降解菌株为新种，广谱菊酯降解菌JZ-2鉴定为Sphingobium wenxiniae sp. nov., 广谱菊酯降解菌JZ-1鉴定为Sphingobium faniae sp. nov. 菌株LQY-7鉴定为Flavobacterium haoranii sp. nov.。LQY-18鉴定为Sphingobacterium wenxiniae sp. nov.。菌株 BA-3鉴定为Sphingobium jiangsuense sp. nov.。相关结果发表于Int J Syst Evol Microbiol。.（2）深入研究了Sphingobium sp. JZ-1对菊酯的降解特性、菊酯结构对降解速率的影响，发现Sphingobium sp. JZ-1对菊酯类农药的降解不存在手性选择性。.（3）阐明了菌株Sphingobium faniae JZ-2降解菊酯的代谢途径，菊酯在菊酯水解酶PytH 催化下生成3-苯氧基苯甲酸（3-PBA），3-PBA 在3-苯氧基苯甲酸1,2双加氧酶作用下断醚键生成3-HBA和邻苯二酚，3-HBA作为中间产物积累并不被继续降解，邻苯二酚则被继续降解。.（4）克隆到菊酯的代谢途径中的各个基因，并确定了其功能，在基因水平上阐明了菊酯微生物降解代谢机制。.（5）获得了一批菊酯水解酶PytH突变体，其中突变体LB37（Y19F，H127R）对联苯菊酯的动力学参数kcat和kcat/Km比原始PytH分别提高6和70倍。.（6）项目执行期间，发表论文16篇（标注基金号），其中SCI论文14篇。