枯草芽孢杆菌BSF01降解高效氯氰菊酯的种内群体感应机制研究

The theory of quorum sensing (QS) can be employed as the foundation and technical guide for the application of pesticide-degrading microorganisms. Based on the previous work, the mutants of Bacillus subtilis BSF01 will be constructed for beta cypermethrin-degrading gene ybfK and QS sensing in the present study. Coupling with multiple techniques including the isolation of effective mutants and the analysis of degradation products, the QS signal molecule will be determined. Then, the binding receptor for QS signal molecule will be identified for the further investigation of signal pathway by molecular docking, fluorescence resonance energy transfer, gene pull-down and site mutation. The regulation of gene ybfK by QS system in strain BSF01 will be discussed based on the gene transcription, degrading enzyme activity and the degradation effects. This study would reveal the QS mechanism of beta cypermethrin biodegradation specifically in strain BASF01, which would fill the gaps of QS research in pesticide-degrading bacteria and facilitates the practical application of the microbial remediation of pesticide residues as a key technique guidance.

微生物群体感应(quorum sensing，QS)理论可为研发面向实践应用的农药残留微生物降解关键技术提供理论指导。在已有工作基础上，本项目将构建枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis BSF01高效氯氰菊酯降解酶基因ybfK突变株和新型QS感应功能突变株；应用突变株筛选以及多种分离技术鉴定QS信号分子；应用分子对接、荧光能量转移、pull-down、定点突变等技术，鉴定QS信号分子受体蛋白，研究信号通路；从基因表达、降解酶活性、降解效果3个层次探讨菌株BSF01的QS机制对降解酶基因ybfK的调控作用，基于QS机制优化菌株BSF01的应用条件。预期结果将阐明菌株BSF01降解高效氯氰菊酯的种内QS机制，理论上可填补微生物降解农药残留的QS研究空白，实践上将指导农药降解菌应用关键技术和产品研发，推动农药残留微生物降解技术的实践应用。

20世纪后期以来，化学农药过量施用现象普遍，成为农业面源污染的重要来源之一。微生物降解被认为是发展潜力巨大的农药残留污染治理技术，但在稳定性、经济性、制剂化、标准化等方面仍面临许多挑战。微生物通过“群体感应”(quorum sensing，QS)信息交流机制协调菌群功能蛋白合成与分泌、菌群密度，抵御污染胁迫。阐明降解菌种内种间QS机制以及QS机制对环境因子的响应，将为突破降解菌应用关键技术提供重要指导。.在已有基础上，本项目证实了枯草芽孢杆菌株BSF01、BS168通过QS机制调节对高效氯氰菊酯（Beta-cypermethrin，β-CP）等菊酯类农药的降解作用；克隆了其降解酶基因ybfK、cesB基因和QS基因簇，构建了酶和QS关键成分△cesB、△comA、△comQ、△comP、△degQ、△degU功能突变株；应用突变株筛选、降解效果和生长量测定、凝胶迁移竞争性试验等技术确定，在β-CP 胁迫下BS168产生QS机制的关键信号分子是ComX，信号受体是ComP， ComA和DegU是其中两个主要转录因子，属于经典的阳性菌QS机制；研究明确了β-CP胁迫下ComQXPA系统及下游基因comQ、comP、comA、degQ、degU对生物膜形成、泳动性、游动性的贡献，发现ComQXPA和DegU-DegQ双组份系统调控枯草芽孢杆菌生物膜的形成从而影响在土壤的定殖。.本项目基本阐明了土壤中枯草芽孢杆菌降解菊酯类农药残留的种内QS机制，优化了基于QS机制的降解应用条件，首次发现确定ComQXPA系统下游转录因子DegU是cesB的转录激活剂，DegU与cesB启动子特异性直接结合，证实了DegU磷酸化是调节Bs168的cesB降解β-CP的必要条件。这些成果理论上丰富了QS研究内容，实践上可指导开发应用农药残留微生物降解新技术。