桉树固有内生细菌种群变化与抗青枯病的关系研究

由Ralstonia solanacearum引起的桉树青枯病防治难度大，至今尚缺乏有效的防治方法。利用植物内生细菌控制该病已显示一定的前景，但防治效果难以持续且不稳定，其主要原因是桉树体内的固有内生细菌与桉树契合紧密，外源内生细菌不易在桉树体内快速繁殖并形成稳定的种群。为此，本课题将以桉树为材料，利用单细胞悬浮培养、茎尖培养和培养基添加抗生素等技术，去除桉树体内的固有内生细菌，结合16S rDNA PCR-DGGE等分子检测技术以期获得真正无内生细菌的愈伤组织和桉树苗；并应用抗病性鉴定技术测定去除内生细菌材料的抗病性，探讨固有内生细菌的抗病功能；在此基础上，对无菌材料接种不同内生细菌种群，检测内生细菌在桉树体内生长情况，选取相互亲和并能有效定殖的菌株人工构建稳定的内生细菌结构，从而解决防治效果难以持续且不稳定的问题，为有效控制桉树青枯病提供理论基础，并为其它维管束病害的防治提供借鉴。

通过对桉树固有内生细菌的检测，探索内生细菌在桉树体内的分布规律和种群多样性，并利用抗生素去除桉树固有内生细菌，检测桉树内生细菌种群变化与抗青枯病的关系，为桉树青枯病的生物防治奠定基础，主要结果如下：.采用培养、光学显微镜观察、电子显微镜观察和PCR检测的方法，对尾叶桉种子无菌萌发的实生苗内的内生细菌进行了研究。结果显示，桉苗的研磨液在不同固体和液体培养基上培养2周，均未检测到可培养的内生细菌；但是在光学显微镜和电子显微镜下观察，能看到很多的细菌，多为短杆状，大小2-3 × 0.5-0.8 μm；应用细菌16S rDNA通用引物扩增尾叶桉实生苗的总DNA，经电泳检测到明亮而清晰的大小为190 kb的DNA条带。试验从多个角度验证了尾叶桉实生苗内存在不可培养的固有内生细菌，可以推测这些内生细菌来源于种子内部。.应用16S rDNA PCR-DGGE技术和平板培养的方法系统地揭示了尾叶桉组培苗中内生细菌的种群多样性。采用冰冻切片法在光学显微镜下观察到桉树不同器官中内生细菌的形态多为球状和短杆状，在桉树的根、茎、叶、根尖、茎尖中均有内生细菌的分布。应用血球计数法对桉苗不同器官中的内生细菌进行数量测定，内生细菌数量在桉树不同器官中的分布规律为：根部﹥茎部﹥叶片。通过方差分析，根部与叶片中内生细菌数量的差异达到显著水平。DGGE电泳图谱显示，桉苗的叶中固有内生细菌种类最多，茎中内生细菌种类最少。在各器官中分布的内生细菌种类既有共同的优势内生细菌，也存在不同的优势内生细菌。克隆测序结果表明，尾叶桉中固有内生细菌的优势种为不可培养细菌。.以同源同代的尾叶桉组培苗为材料，观察比较几种抗生素及其不同浓度的作用效果，确定获得去除桉树固有内生细菌较为合适的抑菌剂种类和浓度，并检测了经抗生素处理后，桉苗固有内生细菌的变化情况和对青枯病的抗性。氨苄青霉素（150 mg/L）和氯霉素（60 mg/L）对桉苗内生细菌的去除有较好的效果，并且对桉苗生长无抑制作用。经含抗生素的培养基培养后，桉苗中固有内生细菌的数量有所减少，但经不含抗生素的培养基培养一段时间其数量又有所恢复。经氨苄青霉素和氯霉素处理的尾叶桉苗，其青枯病的发病时间与对照相比延后1-2 d。尤其经氨苄青霉素处理后，桉苗的发病率与对照相比有显著性降低。