基于胞内NADH含量和生物裂解技术进行海产品致病菌的生物发光快速检测

微生物污染造成的食源性疾病是我国食品安全的首要问题之一。本课题借助于噬菌体专一性裂解技术，以致病菌细胞内NADH含量为检测指标，通过海洋发光细菌荧光素酶－NADH:FMN氧化还原酶体系进行海产品中致病菌的检测，建立了一种基于全新理论的微生物检测共性技术。首先采用宽宿主谱噬菌体对海产品中致病菌进行专一性裂解，使细胞内的NADH释放出来；利用海洋发光细菌提取荧光素酶和NADH:FMN氧化还原酶，构建体外双酶发光体系；将胞内NADH提取物和发光作用底物同时添加到双酶发光体系中，对发光强度进行检测，根据所建立的发光强度与体系中NADH含量的线性关系来对海产品中致病菌的含量进行分析。本检测方法可以实现快速、高灵敏度和高特异性的目的，并可望在海洋环境微生物的监控、海产食品等相关产品的无损检测中发挥作用。

建立一种快速、简便、灵敏、特异性强的病原菌的检测方法有很重要的现实意义。本研究从筛选高效副溶血弧菌噬菌体出发，利用噬菌体的高度宿主专一性实现副溶血弧菌的特异性检测，结合细菌荧光素酶-FMN:NADH氧化还原酶体外发光体系实现副溶血弧菌的快速检测。.以副溶血弧菌VP 17802为宿主菌，采用双层琼脂平板法从污水样品中分离得到34株副溶血弧菌噬菌体qdvp001、VPp1、VPp2、VPp3，遗传物质均为双链DNA；正二十面体的头部。VPp1无尾，属盖噬菌体科，qdvp001、VPp2、VPp3属于肌尾噬菌体科。.对qdvp001、VPp1、VPp2、VPp3进行裂解性能分析比较，综合分析各因素，发现VPp1是符合条件的潜伏期短裂解量大的理想噬菌体株系，因此选定VPp1用于后续实验。VPp1全基因组序列包含64个推定基因，每个推定基因在数据库上进行同源性比对分析，结果表明VPp1是一株新发现的噬菌体。.为了使细菌细胞内的NADH更多的释放到胞外，本研究从噬菌体效价、裂解时间、噬菌体与宿主菌的体积比三个方面进行噬菌体裂解宿主菌的裂解条件优化，结果表明：噬菌体效价越高越能在短时间内将宿主菌裂解完全，考虑到噬菌体增殖液制备的便利性，检测体系中确定噬菌体的效价为1010 pfu/mL；裂解时间为15 min；体积比为1:1。.将噬菌体VPp1结合细菌荧光素酶-FMN:NADH氧化还原酶体外发光体系进行副溶血弧菌的定量检测，结果表明：副溶血弧菌的数量在0.31×108~6.18×108 cfu/mL范围内时，曲线的拟合方程为y=1938.3x+2906.1，两者线性相关系数R2值为0.9813，呈现一定的线性关系；副溶血弧菌的数量在0.31×108~5.03×108 cfu/mL范围内时，曲线的拟合方程为y=2129.4x+2611.5，两者线性相关系数R2值为0.9954，线性关系良好。方法检出限为2.64×107 cfu/mL。在副溶血弧菌纯培养液及牡蛎样品中的平均加标回收率分别为96.28%与 91.92%，表明方法准确度高，具有可行性。在VP纯培养液及牡蛎样品中的重复性试验结果表明，相对标准偏差RSD分别为0.72%与0.68%，均小于1%，表明该方法重复性好，精密度高。整个检测过程（包括增菌过程与裂解测定过程）在4.5 h之内可以完成。