综合应用质谱、核磁共振方法研究病原性大肠杆菌酪氨酸磷酸化激酶的自磷酸化、互磷酸化的动力学和分子机制

致病型大肠杆菌K12的酪氨酸磷酸化激酶(etK, E. coli Tyrosine Kinase)是属于第四类分泌复合体的一个膜蛋白，其胞内结构域具有酪氨酸磷酸化激酶的功能，并对细菌表多糖的合成、分泌和形成起着关键作用。研究结果表明etK蛋白具有两步磷酸化的机制：首先自我磷酸化底物结合区中的Tyr574,以此激活自身激酶活性；再通过互磷酸化另一个etK分子C-末端Tyr富集区中的Tyr，促进多糖分子的合成和分泌功能。但是，目前还没有获得该蛋白磷酸化后，即活化状态的三维结构，使得etK磷酸化激酶在自磷酸化、互磷酸化过程的动力学及分子机制还不甚明了。本项目为加深理解etK蛋白在磷酸转移过程中的动力学特性和分子机制，将应用质谱方法监测etK蛋白Tyr574位点和C-末端Tyr富集区随时间变化的磷酸化水平；同时，应用液体核磁共振方法研究与etK激酶功能密切相关的位点在磷酸转移过程中的动力学过程。

酪氨酸磷酸化激酶ETK是大肠杆菌的含有跨膜结构域和胞内磷酸化激酶结构域的膜蛋白。前期研究表明ETK胞内磷酸化激酶功能先通过自磷酸化Tyr574位点后，使得其他ETK分子的C-末端富含Tyr的尾部结合到激酶活性位点，启动互磷酸化途径。因此，自磷酸化Tyr574位点是ETK激酶活动的关键起点。针对ETK胞内激酶结构域的酶活，我们发展了基于非天然氨基酸Tyr-F2的方法，结合质谱方法实现了ETK-Y574位点磷酸化的定性和定量分析；在此基础上实现了原位条件下全长膜蛋白ETK-Y574的磷酸化定量分析，并开展了随着时间变化的自磷酸化动力学分析。相关文章已经发表在Angewante Chemie Int. Ed. (2013) 和Protein Cell （2015）上，顺利完成了本项目的研究任务，达到了项目的预期研究目标。