从RIP1/ROS通路探讨脂多糖诱导肠道L细胞凋亡致GLP-1分泌减少的机制研究

The hyposecretion of glucagon-like peptide (GLP-1) is the main features of the incretin hormone effect associated with Type 2 Diabetes Mellitus(T2DM). There are more and more evidence indicating that Intestinal dysbacteriosis plays a considerable role in the development of T2DM by inhibiting the secretion of GLP-1. However, the hyposecretion of GLP-1 caused by intestinal dysbacteriosis is still poorly understood. Our preliminary study in vitro confirmed that RIP1 (Receptor-Interacting Protein kinase 1) played important roles on apoptosis of intestinal L cells induced by lipopolysaccharide (LPS). In view of above evidences, we hypothesize that LPS promote apoptosis of intestinal L cells and inhibite the expression the mRNA of GLP-1 through activating the RIP1-ROS system. This program aims to investigate the effect of LPS on apoptosis of intestinal L cells and the expression of GLP-1 Mrna using GLUTag cells and spontaneous type 2 diabetic animal model OLETF rats, and simultaneously explore the possibilities of signaling pathway in vivo and in vitro using RT-PCR,Western blot, RNA interference, et al. The confirmation of the above issues will privide a new path and drug targeting for the prevention and therapy of T2DM.

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）分泌减少是2型糖尿病患者肠促胰素效应受损的主要特点。迄今肠道菌群失调致GLP-1分泌减少的机制仍知之甚少。我们的预实验结果提示：受体相互作用蛋白1（RIP1）在肠道菌群代谢产物脂多糖（LPS）诱导的肠道L细胞凋亡中起重要作用，但其作用机制还有待进一步探讨。为此，我们提出假说：RIP1/ROS可能通过诱导氧化应激调控炎症因子促进肠道L细胞凋亡，致GLP-1分泌减少。为了验证这一假说，本研究将以GLUTag细胞和自发性糖尿病大鼠作为研究对象，采用RT-PCR、Western blot、过表达质粒构建、RNA干扰等手段，从分子、细胞及动物整体水平探讨RIP1在肠促胰素效应受损中的重要作用，明确RIP1通过诱导氧化应激调控细胞凋亡和GLP-1分泌。本研究将从RIP1这个新视点为揭示肠促胰素效应受损的发生机制奠定基础，为2型糖尿病及其并发症的防治提供新的思路。

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）分泌减少是2型糖尿病患者肠促胰素效应受损的主要特点。迄今肠道菌群失调致GLP-1分泌减少的机制仍知之甚少。我们的预实验结果提示：受体相互作用蛋白1（RIP1）在肠道菌群代谢产物脂多糖（LPS）诱导的肠道L细胞凋亡中起重要作用。为此，我们提出假说：RIP1/ROS通过诱导氧化应激调控炎症因子促进肠道L细胞凋亡致GLP-1分泌减少。本研究结果证实：LPS呈剂量依赖性诱导细胞凋亡、促进ROS产生，LPS可升高caspase 3/7活性、降低GLP-1 mRNA及蛋白的表达，增加RIP1、RIP3 mRNA及蛋白的表达、降低mTOR相关蛋白p-mTOR和p-S6的表达；采用siRNA干扰技术沉默RIP1、RIP3的表达，ROS的产生减少，caspase 3/7活性降低，GLP-1 mRNA及蛋白的表达增加，mTOR相关蛋白p-mTOR和p-S6的表达增加；抗氧化剂NAC抑制LPS诱导的肠道L细胞凋亡，抑制ROS产生，促进GLP-1的表达，拮抗LPS对mTOR相关蛋白p-mTOR和 p-S6表达的抑制作用，而mTOR抑制剂Rapa能够逆转NAC的上述作用。综上，LPS通过RIP/ROS/mTOR通路诱导肠道L细胞凋亡致使GLP-1分泌减少。.MiRNAs从转录后水平调控真核生物基因表达。预实验结果显示：mir-425-5p在高脂喂养小鼠回肠组织和LPS诱导的GLUTag细胞中升高。因此，本研究探讨了miR-425-5p在LPS抑制GLUTag细胞GLP-1分泌和高脂饮食糖尿病小鼠糖代谢中的作用及机制。miR-425-5p与PTEN显著相关；抑制miR-425-5p表达，促进细胞凋亡，降低胰高血糖素原基因表达和β-catenin活性；萤光素酶活性试验结果证实了mir-425-5p靶向调控PTEN；抑制PTEN表达促进LPS诱导NF-κB转移到细胞核内。ChIP和萤光素酶测定结果表明：β-catenin作为胰高血糖素原基因启动子的顺式反应元件，促进胰高血糖素原转录，NF-κB介导了miR-425-5p表达。综上，NF-κB/miR-425-5p/PTEN/β-catenin在高脂喂养小鼠的GLP-1产生中发挥重要作用。.本研究从RIP1和miR-425-5p这两个新视点揭示了肠促胰素效应受损的发生机制，为2型糖尿病及其并发症提供了新的思路。