基因融合提升巨大芽孢杆菌抑制黄曲霉活性蛋白活性的研究

A strain of marine Bacillus megaterium exhibited inhibitory effect on the growth of Aspergillus flavus and the genes expression involved in aflatoxin biosynthesis by producing specific proteins. In order to enhance the inhibitory effect, this project aims at identifying and elucidating the structure of these bioactive inhibiting proteins to A. flavus from B. megaterium by using efficient separate technology, LC-MS, NMR, etc. Based on the structure information, the encoding genes can be cloned. Then the overexpression vector and the antisense RNA plasmid will be constructed and transferred into Bacillus megaterium for expression, in order to validate the function of the encoding genes. Finally, the molecular modification technology is used to enhance the inhibitory effect of these inhibiting proteins to growth and aflatoxin biosynthesis in A. flavus. This research can elucidate the mechanism of inhibiting growth and aflatoxin biosynthesis of A. flavus by B. megaterium. And this research is also significant for the usage of secondary metabolites from microorganisms in food to inhibit aflatoxin biosynthesis.

本项目申请人前期研究发现，一株海洋巨大芽孢杆菌主要通过产生蛋白类物质来抑制黄曲霉的生长和黄曲霉毒素生物合成基因的表达。然而，此蛋白类物质的抑制效果有待提高，于是本项目主要采用高效的分离技术，并借助液相质谱联用仪、核磁共振波谱仪等仪器设备，对此株巨大芽孢杆菌中抑制黄曲霉活性蛋白进行结构鉴定和解析；根据鉴定出的抑制黄曲霉活性蛋白结构信息，克隆出其编码基因；通过巨大芽孢杆菌中转入过表达载体和反义RNA载体，对得到的抑制黄曲霉活性蛋白编码基因的功能进行比较研究；最后，通过对抑制黄曲霉活性蛋白的分子改造，提升其对黄曲霉生长和黄曲霉毒素生物合成的抑制作用。此项研究不仅能够推动关于拮抗微生物抑制黄曲霉生长和毒素生物合成的理论发展，还将为应用微生物次级代谢产物抑制黄曲霉毒素在食品中的合成提供指导。

黄曲霉毒素是一类能够致癌、致畸和致突变的真菌毒素，我国农产品中黄曲霉毒素污染严重。申请人前期发现，一株海洋巨大芽孢杆菌产生多种代谢产物来抑制黄曲霉的生长和黄曲霉毒素的合成。本项目采用高效的分离技术，并借助液相质谱联用仪等仪器设备，从巨大芽孢杆菌发酵液中鉴定出46种脂肽和20余种短肽，这些代谢产物均可直接或间接的抑制黄曲霉生长和产毒素，其中Bacillomycin D和三种短肽（DO，DN，DDN）的抑制效果最好，阐明了巨大芽孢杆菌抑制黄曲霉的机制。研究表明，Bacillomycin D主要作用于黄曲霉细胞膜来抑制黄曲霉生长，最小抑菌浓度(MIC)为50 μg/mL，最小杀菌浓度(MFC)为200 μg/mL；而短肽的作用位点更加多样，不仅可以破坏细胞膜，而且可以进入黄曲霉细胞内部，干扰黄曲霉的DNA、RNA和蛋白质的合成，MIC为600 μg/mL，MFC>900 μg/mL。进而，申请人利用基因融合技术，将抑制黄曲霉短肽和黄曲霉AflR蛋白的双核锌指超二级结构融合表达，融合蛋白DN-AflR的MIC为150 μg/mL，MFC为400 μg/mL，大大提高了抑制黄曲霉活性蛋白的作用效果，具有很好的应用前景。另外，申请人还探讨了利用固态发酵技术生物转化花生和玉米中黄曲霉毒素的方法，转化率在90%以上；从芽孢杆菌、乳酸菌中发现多种可以生物转化黄曲霉毒素B1的酶类，并用大肠杆菌和毕赤酵母为宿主进行外源大量表达。这些成果有助于推动关于拮抗微生物抑制黄曲霉生长和毒素合成的理论发展，对保障我国的食品安全具有重要意义。受此项目资助，目前项目组发表SCI收录论文13篇（其中中科院分区小类一区2篇，小类二区6篇），中文核心期刊论文4篇；申请国家发明专利1项；培养硕士研究生7名。