草鱼体表粘液抗菌肽的细胞膜色谱制备法和抗菌机理的研究

Antimicrobial peptides (AMPs) are a kind of small peptides widely in organism with a broad spectrum of biological activities against bacteria, fungi, viruses, parasites and cancer cells. AMP plays an important role in the innate immune system of fish and shows a good promising application in aquaculture. In order to obtain the AMP with high efficiency, broad-spectrum antibacterial activity and explore its antibacterial mechanism, grass carp (Ctenopharyngodon idella) will be used as the experimental object in the present study. A novel AMP is screened from skin mucus by cell membrane chromatography (CMC). Amino acid sequence is identified by the mass spectrometry. Then the eukaryotic expression vector is constructed and the recombinant AMP proteins are expressed in epithelioma papulosum cyprinid (EPC) cells. The antibacterial and antiviral activities of recombinant protein will be analyzed. The AMP application in grass carp aquaculture is explored in preliminary. Through optimized combination of the research methods, the kinetics of antibacterial action of AMP, the destruction to outer wall and inner membrane of bacteria, the ultrastructure of bacteria and the location in the bacteria will be experimented. The above experiments are aimed to the antibacterial characteristics and mechanism of AMP. The purpose of this project is to establish the environmental and efficient method for isolation and purification, clarify the mechanism and finally provide a theoretical basis and technical support for the development and utilization of AMP.

抗菌肽是一类广泛存在于生物界的小分子多肽，具有广谱地抗细菌、病毒、真菌、寄生虫和肿瘤细胞等生物活性。在鱼类的先天免疫系统中，抗菌肽占据着重要的作用，在水产养殖业显示出良好的应用前景。为了筛选到高效且抗菌谱广的抗菌肽分子，探索抗菌肽的作用机理，本项目将以草鱼为研究对象，通过细胞膜色谱法筛选体表粘液的抗菌肽，质谱分析其氨基酸组成，构建真核表达载体，在鲤上皮细胞中表达抗菌肽蛋白，对其抗菌和抗病毒活性进行分析，并初步探索抗菌肽在草鱼养殖中的应用。通过对抗菌肽机理的研究手段进行优化组合，研究抗菌肽的抑菌动力学、对菌体外壁和内膜的破坏影响、对细菌超微结构的影响以及在细菌体内的定位情况，探讨抗菌肽的抗菌特征和作用机理。通过本项目的研究，建立环保、高效的抗菌肽分离纯化方法，阐明抗菌肽的抗菌机理，为抗菌肽的开发利用提供理论依据和技术支持。

抗菌肽 (antimicrobial peptides, AMPs) 是一类对细菌、真菌、病毒、寄生虫、原生动物和肿瘤细胞等具有杀伤作用的小分子多肽 (12‒50个氨基酸)，是生物体先天性免疫防御系统的重要组成部分。本项目从草鱼中获取了5个抗菌肽，其中包括3个NK-lysin基因 (nkla, nklb和nklc) 和2个β-thymosins (Tβ) 基因 (Tβ-a和Tβ-4)， NK-lysin是机体自然杀伤 (natural killer, NK) 细胞和细胞毒性 T细胞 (cytotoxic T lymphocytes, CTLs) 中存在的一种被称之为“颗粒溶素”的抗菌肽，β-thymosin（胸腺素）是一类多功能的蛋白因子，在组织修复和再生、抗炎、血管再生等方面起着重要作用，同时还具有抗菌的作用。通过荧光定量PCR检测其在健康草鱼的组织和细菌感染后免疫相关组织中的转录水平。原核和酵母表达系统获得Nkla的重组蛋白，对其抑菌功能和蛋白特性进行了分析，并对其抑菌机理进行了研究。草鱼nkla, nklb和nklc分别编码121，122和121个氨基酸，均属于鞘脂激活蛋白样蛋白家族成员（SAPLIP），含有6个高度保守的半胱氨酸和1个SapB结构域。基因组均包含4个外显子和3个内含子。Tβ-a和Tβ-4分别编码47、44个氨基酸，基因组由2个外显子和1个内含子组成。在健康草鱼的各组织中，nkla、nklb、nklc、Tβ-a和Tβ-4主要在免疫相关的组织中表达。草鱼经嗜水气单胞菌感染后，5种抗菌肽在部分免疫相关的组织中表达量上调，揭示该抗菌肽在宿主的先天性免疫防御中发挥免疫调节的作用。为研究抗菌肽潜在的应用价值，分别在原核和酵母表达系统中表达Nkla重组蛋白，通过对其抑菌功能和稳定性的研究，结果显示：Nkla对G+和G-细菌均具有抑菌作用，并且对水产动物病原菌嗜水气单胞菌和爱德华菌的抑菌能力较强，同时对抗菌肽的溶血性和抗蛋白酶的能力进行了分析，该抗菌肽对草鱼红细胞的溶血率较低，并能够抗胰蛋白酶和胃蛋白酶的分解，表明该抗菌肽有望成为预防和治疗鱼类疾病的理想药物。为研究抗菌肽的作用机理，Nkla与细菌作用后，电镜观察了细菌形态的变化，发现细菌细胞膜破裂，内容物流出，细菌基本形态破坏。综合上述研究结果，本项目丰富了鱼类的抗菌肽资源库，并显示了广阔的开发应用前景。