创新霉素生物合成途径的阐释和异源表达

Chuangxinmycin, as a novel indole alkaloids antibiotic, was firstly discovered in China and effective for treatment of septicaemia, urinary and biliary infections caused by Escherichia coli in preliminary clinical trial. It is featured with a rare structure (thiopyrano[4,3,2-cd]indole) and its ability to inhibit a special target (bacterial tryptophanyl tRNA synthetase). Up to now, the biosynthetic pathway of this antibiotic remains still obscure. The present project intends to clarify the biosynthetic pathway of chuangxinmycin : Firstly, we will screen the proposed chuangxinmycin biosynthetic gene cluster based on bioinformatic analysis of the genome of chuangxinmycin-producing Actinoplanes tsinanensis. Subsequently, using Red/ET recombineering, we intend to clone directly the complete gene cluster and transfer it into a heterologous host for efficient expression and identify the completeness of chuangxinmycin biosynthetic gene cluster. Then, we will clarify the biogenesis of sulfur in chuangxinmycin and the mechanism of thiopyrano[4,3,2-cd]indole formation by gene inactivation and in vitro enzymatic reactions. Finally, we plan to generate novel derivatives by combinatorial biosynthesis for further efficacy evaluation. Our investigations here will help elucidate the biosynthetic pathway of chuanxinmycin, representing a novel family of antibiotics, as well as enrich the gene resources for the novel thiopyrano[4,3,2-cd]indole formation and open a possibility to produce more engineered natural products used for drug development.

创新霉素是中国发现的第一个全新结构的抗生素，对于大肠杆菌引起的败血症、胆囊炎和尿路感染等疾病有显著的疗效。创新霉素识别的靶标独特(细菌色氨酰tRNA合成酶)，且结构新颖，但生物合成机制还未阐明。前期工作对创新霉素产生菌-济南游动放线菌-进行了全基因组测序(预计2015年5月完成)，本项目拟对其基因组序列进行生物信息学分析，对可能的创新霉素生物合成基因簇进行大片段直接克隆，导入合适异源宿主细胞进行表达，鉴定基因簇的完整性；进而通过对关键基因进行失活、基因回补、体外酶反应以阐明创新霉素分子中硫的生源途径和吲哚并噻喃三环的合成机制；最后通过组合生物合成等手段产生新的衍生物用于进一步的药效评价。本项目有助于阐释创新霉素中稀有的含硫杂环体系的生物合成机制，也为将来的药物开发提供重要的基因资源。

创新霉素是由中国科学家发现的第一个全新结构的抗生素，含有独特的吲哚骈噻喃三环结构，是细菌色氨酰tRNA合成酶的抑制剂，临床试验显示对大肠杆菌引起的败血症、胆囊炎和尿路感染具有一定的治疗效果。为了发掘创新霉素作为先导化合物的潜力，本项目利用异源表达结合基因敲除探究创新霉素的生物合成途径和调控机理。首先对创新霉素产生菌济南游动放线菌进行全基因组测序，通过扫描抗性基因-色氨酰tRNA合成酶的方法，定位创新霉素基因簇Cxm0-9，包含转录调控因子Cxm1，转运蛋白Cxm2，硫载体蛋白Cxm4参与S原子的渗入，P450单加氧酶Cxm5和还原酶Cxm6负责噻喃环形成，甲基转移酶Cxm8和Cxm9负责甲基化。由于本源菌难以操作，将cxm0-9直接克隆到大肠杆菌载体上，并转入三个链霉菌异源宿主中，均能产生创新霉素，及甲基创新霉素和新化合物4，说明该基因簇负责创新霉素生物合成。进一步试验确定Cxm1是正转录调控因子；VB12依赖自由基SAM蛋白Cxm8和假定蛋白Cxm9共同负责C-3的甲基化，这是首次发现两个酶共同催化单个甲基化；Cxm34在异源宿主能够产生化合物4，说明负责S原子渗入；Cxm3456能够产生去甲基创新霉素，说明Cxm56与S-杂环的形成相关，因此确定了负责独特吲哚骈噻喃三环结构的四个酶Cxm3456。我们还对酶功能进行生化实验验证，成功表达并纯化得到功能蛋白Cxm34567。生化实验证实Cxm7催化色氨酸形成吲哚丙酮酸，起始创新霉素生物合成。其它酶的生化试验仍在探索中。本研究确定了创新霉素的生物合成基因簇，提出了生物合成途径，为体外阐明吲哚骈噻喃三环结构的生物合成和体内组合生物合成产生新衍生物奠定了基础。.项目资助发表论文5篇，其中SCI论文4篇；申请发明专利一项。培养研究生三名，其中一名已经取得博士学位，两名硕士生在读。