高通量异源表达激活链霉菌沉默抗生素生物合成途径

Genomes of streptomycetes hold an enormous number of silent antibiotics biosynthetic gene clusters. How to activate these natural products resources so that we can use them to combat the increasing multidrug resistant pathogens? We have established a high-throughput heterologous expression protocol and applied it to screen for global activators which can awaken silent gene clusters in a previous study. We then utilized one of these activators to construct a Streptomyces lividans strain SBT5. Using SBT5 as a host for high-throughput heterologous expression of the genomic BAC library of Streptomyces grieoruber Sgr29, we observed several groups of antibacterial activities which were not found in the original Sgr29 strain. Based on this preliminary observation, we proposed here to further optimize the secondary metabolic potential of SBT5, and used the resulting optimized strain as an efficient high-throughput heterologous expression host to activate the silent antibiotics biosynthetic pathways for screening of novel antibiotics and their biosynthetic gene clusters from streptomycetes.

链霉菌的基因组编码大量沉默的抗生素生物合成基因簇，如何高效激活这些天然产物资源，以应对人类面临的多重耐药菌严峻挑战？我们前期研究建立了链霉菌基因组文库的高通量异源表达技术，用于筛选可激活沉默基因簇的全局性正调控基因，用获得的基因优化变铅青链霉菌得到菌株SBT5；用SBT5为宿主，高通量异源表达野生链霉菌Sgr29的基因组BAC文库，激活了链霉菌Sgr29原先不能生产的多个抗菌活性物质。在此基础上，本项目旨在进一步强化SBT5的次级代谢能力，高通量异源表达多种野生链霉菌的基因组大片段BAC文库，激活沉默的抗生素生物合成途径，借此高效发现新抗生素及其对应的基因簇，建立一个高效率的异源表达筛选抗生素及其基因簇的平台技术。

通过优化变铅青链霉菌获得SBT18等多个菌株，比较异源表达聚酮、非核糖体肽和核苷等不同种类抗生素的效率，发现其中SBT18最适合作为文库高通量异源表达的宿主。以SBT18为表达宿主，建立了一个可高通量操作的、以活性为导向的基因组文库异源表达与筛选体系(LEXAS)。将LEXAS技术应用于挖掘四株链霉菌的活性天然产物及其基因簇。其中，从娄彻氏链霉菌Sal35中鉴定两个已知抗生素链丝菌素和疏螺旋体素及其基因簇，发现两个新结构的线性脂肽及其基因簇，以及一个抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的新抗生素雷可肽（lexapeptide）；从其它菌株中克隆和异源表达了卓酚酮、醌那霉素、抗霉素、放线菌素D、村山醌、杀粉蝶菌素等八种抗生素的完整基因簇。其中，村山醌和雷可肽只能通过异源表达产生，在我们的原始菌株中不表达产物，是沉默的。利用LEXAS技术筛选所获得的基因簇，研究了村山醌、卓酚酮和雷可肽的生物合成途径。村山醌的生物合成包含一个三环直连蒽醌到角环菲醌的氧化重排过程，我们通过遗传和生化实验揭示参与该重排事件的不稳定中间体和三个关键氧化还原酶。3,7二羟基卓酚酮可螯合多种重金属离子，在微生物生理、生态和相关天然产物药物研发中均具有重要意义，我们在链霉菌中发现一个综合了分支酸与苯丙酮酸合成代谢、苯乙酰辅酶A分解代谢和次级代谢高效汇聚合成卓酚酮次级代谢产物的典型途径，为相关化合物的生态效应及其药物开发奠定基础。雷可肽的合成则揭示出一类新型核糖体肽合成途径，为该类抗菌肽作为药物或肽类食品防腐剂的研发奠定扎实基础。另外，本项目建立的该高通量挖掘方法（LEXAS）可应用于各种链霉菌和放线菌，适用于沉默基因簇及其活性代谢产物的激活与挖掘，可以推广应用于活性天然产物及其生物合成途径的大规模筛选。