创新霉素的生物合成机制研究

Chuangxinmycin is an antibiotic isolated from Actinoplanes tsinanensis CPCC 200056 in the 1970s with a novel indole-dihydrothiopyran heterocyclic skeleton and a unique antibacterial mechanism. Chuangxinmycin showed in vitro antibacterial activity and in vivo efficacy in mouse infection models as well as preliminary clinical trials. As recently the antibiotic-resistant bacteria such as ESKAPE pathogens become a serious emerging problem, chuangxinmycin attracted the interests of scientists again. But the biosynthetic pathway of chuangxinmycin has been obscure since its discovery. Based on genome sequencing and bioinformatics analysis, we identified a stretch of DNA from the genome of A. tsinanensis CPCC 200056 that encodes genes for chuangxinmycin biosynthesis. The designated cxn cluster was then confirmed to be responsible for chuangxinmycin biosynthesis by direct cloning and heterologous expressing in Streptomyces coelicolor M1146. Based on these results, a plausible biosynthetic pathway for chuangxinmycin biosynthesis was proposed, by hijacking the primary sulfur transfer system for sulfur incorporation. In this research, we will elucidate the detail biochemical machinery for chuangxinmycin biosynthesis using in vivo genetic manipulation and in vitro enzymatic studies, especially the mechanisms for the incorporation of S, the formation of the second C-S bond and C-methylation, etc. Based on the understanding of its biosynthetic mechanism, we will construct cell factories for efficiently producing chuangxinmycin and its derivatives by means of synthetic biology. The new biosynthetic parts or modules pertaining to chuangxinmycin biosynthesis will be mined in genomes from both GenBank and the genomic libraries of actinomycetes preserved in our laboratory. The novel derivatives will be produced by means of mutasynthesis, combinatorial biosynthesis and synthetic biology, providing the basis for the discovery and development of novel antibiotics for fighting antibiotic resistance.

创新霉素是我研究所上世纪70年代发现的抗生素，对革兰氏阴性和阳性菌均有活性，靶标新颖，毒性低，在当前抗生素耐药问题愈发严重的情况下，其研发将具有新的意义。合成生物技术的应用将有力推动创新霉素及新衍生物的研究，但迄今为止对其生物合成机制的认识仍非常有限。创新霉素结构母核为吲哚骈二氢噻喃环，其特点是含有一个S原子，在对创新霉素生物合成步骤分析的基础上，我们定位并克隆了其生物合成基因簇，并成功进行了异源表达，初步推测了其生物合成过程，其中S原子掺入利用了初级代谢的硫转移系统。本项目将通过体内遗传操作和体外生化反应等手段对其生物合成机制进行系统深入的研究，明确S的掺入、C-S键成环、甲基化等酶催化机制；在此基础上构建创新霉素及其衍生物的高效细胞工厂，利用基因组发掘技术发现创新霉素相关的生物合成新元件，利用合成生物学方法获得结构优化的新衍生物，为具有抗耐药潜力的新抗生素研发奠定基础。

创新霉素是我研究所上世纪70年代发现的抗生素，对革兰氏阴性和阳性菌均有活性，靶标新颖，毒性低，在当前抗生素耐药问题愈发严重的情况下，其研发将具有新的意义。合成生物技术的应用将有力推动创新霉素及新衍生物的研究，但迄今为止对其生物合成机制的认识仍非常有限。本项目在天蓝色链霉菌中构建创新霉素不同基因组合的生物合成基因簇，确定最小基因簇。在此基础上构建生物合成关键基因阻断株，分析重组菌株的代谢产物，推测生物合成酶的功能；利用重组酶进行体外生化反应验证酶的功能，综合晶体学研究结果，重点阐明创新霉素生物合成过程中第二个C-S键形成机制，首次揭示了细胞色素P450酶CxnD在创新霉素生物合成中催化分子内芳香碳C(sp2)-H硫醚化、形成吲哚骈噻喃三环骨架的分子机制，拓宽了人们对天然产物生物合成中C-S键形成机制的认识。甲基化反应证实由自由基依赖的SAM家族的甲基转移酶CxnA及其辅助蛋白Ats4177共同催化完成，这在次级代谢产物中甲基化反应中较为罕见，而且经实验证明该甲基化系统可以被重复利用进行二次甲基化，产生新衍生物⸺甲基创新霉素，经抗菌活性测定进一步说明甲基对创新霉素类化合物的生物活性至关重要。结合文献报导的二氢噻喃环中S的掺入机制，目前创新霉素的生物合成过程得到解析。将创新霉素最小生物合成基因簇初步在不同链霉菌菌株中表达，获得创新霉素的高效合成。以创新霉素生物合成关键酶CxnD进行GenBank和自有微生物基因组文库的基因组发掘，发现24个新的创新霉素类生物合成基因簇，并从中发现新的生物合成元件；利用生物合成基因功能指导和前体定向指导共产生创新霉素的新结构衍生物6个，正在进行初步的活性评价。通过本项目的实施阐明了创新霉素生物合成的具体机制，发掘获得了新的创新霉素衍生物生物合成相关元件，为利用合成生物学方法获得结构优化的新衍生物从而筛选出具有抗耐药潜力的新抗生素进行研发奠定了基础。