尪痹片通过调节中性粒细胞NETosis治疗类风湿关节炎的机制研究

NETosis is the formation and release process of neutrophil extracellular traps (NETs). In recent years, studies have found that abnormal NETosis play important roles in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA). Firstly, NETosis is correlated with the production of RA-related antibodies, including anti-citrullinated protein antibodies (ACPAs). Secondly, NETosis could lead to RA joint tissue damage directly. Thirdly, NETosis can increase the expression of inflammatory mediators. Increased antibodies and inflammatory mediators could stimulate NETosis to produce more NETs forming a vicious cycle. Wangbi Pills is an effective prescription in the treatment of RA. However, the mechanism of Wangbi Pills is not very clear. In the preliminary experiment, we have found that Wangbi Pills could effectively reduce the index scores of mice with collagen-induced arthritis. Wangbi Pills also reduced the antibody titer of RA mice. In vitro, Wangbi Pills decreased the production of NETs and inflammatory mediators. Based on previous research, we propose a hypothesis that Wangbi Pills could treat RA by regulating neutrophil NETosis. This project is expected to provide valid biological evidence to clarify the mechanism of Wangbi Pills in the treatment of RA.

中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成和释放过程称为NETosis。近年研究发现，异常的中性粒细胞NETosis在RA发病中起到重要作用。首先，NETosis与抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPAs)生成密切相关；其次，NETosis能够直接造成RA关节组织损伤；第三，NETosis能够增加促炎细胞因子的表达。增多的ACPAs和促炎细胞因子能够放大炎症级联反应，募集活化更多的中性粒细胞，激发NETosis，形成恶性循环。尪痹片是临床治疗RA的有效方药，其具体机制尚不明确。我们前期研究发现，尪痹片可以改善RA小鼠关节炎症状，降低小鼠特异性抗体浓度。细胞实验中，尪痹片可以抑制活化的中性粒细胞形成NETs和表达炎性因子。基于前期研究，我们提出假说，尪痹片通过调节中性粒细胞NETosis，打破炎症恶性循环治疗RA。本项目计划通过动物到细胞不同层面研究，明确尪痹片作用机制，为其临床应用提供有力的生物学依据。

类风湿关节炎（RA）是一种常见的自身免疫性关节炎。既往研究大多认为RA与特异性免疫失调密切相关。随着最近几年对固有免疫的重新认识，研究者发现固有免疫系统在许多自身免疫性疾病如RA的发生发展中也起到重要的作用。本项目从调节中性粒细胞NETosis角度入手，探索中医临床有效方药尪痹片作用的新靶点，分析尪痹片治疗RA的作用机制。我们首先采用RA动物模型，通过检测尪痹片对RA小鼠模型炎症的缓解作用，分析中性粒细胞NETosis的活性，以及相关炎性因子的表达，在动物模型上分析尪痹片对中性粒细胞NETosis的调节作用。我们研究发现，不同浓度尪痹片组能够降低小鼠关节炎评分和关节直径。H-E、甲苯胺蓝染色、番红-固绿染色分析关节部位表明，尪痹片可以缓解炎症、减少炎性细胞浸润、减少关节软骨破坏。关节免疫组化研究表明，尪痹片可以减少中性粒细胞浸润，降低NETosis相关指标MPO、PAD4、NE的表达。血清炎性细胞因子与关节炎部位炎性细胞因子的检测发现尪痹片治疗组能够明显降低炎性因子含量。细胞实验方面，我们体外纯化中性粒细胞，诱导中性粒细胞 NETosis，研究尪痹片通过调节中性粒细胞NETosis减轻炎症的机制。我们发现不同浓度尪痹片实验组能够抑制NETs相关蛋白的表达，抑制NETs中的成分包括MPO、NE等的含量。尪痹片还能抑制中性粒细胞炎性因子的表达。转录组测序结果表明，尪痹片显著下调中性粒细胞炎症相关基因的表达、增强中性粒细胞凋亡相关基因的表达、抑制趋化基因的表达。我们通过从动物到细胞不同层面的研究，证实尪痹片对中性粒细胞NETosis的调节作用，明确尪痹片的作用靶点，为该方治疗RA的临床应用提供生物学依据，增进学界对尪痹片通过调节固有免疫治疗RA的复杂性和多样性的认识。为补益肝肾、祛风除湿通络法治疗RA的临床拓展和推广提供理论基础。