蛋白质O-GlcNAc糖基化动态检测新技术的开发及其在早期胚胎发育研究中的应用

O-GlcNAcylation is a reversible and dynamic process that involves the addition and removal of a single N-acetylglucosamine molecule on Ser/Thr residues of proteins. As a major nutrient sensor in the cell, it regulates many important cellular processes including signal transduction, transcription, epigenetics, and metabolism. Proper O-GlcNAc level, maintained by two opposing enzymes, O-GlcNAcase (OGA) and O-GlcNAc transferase (OGT), is essential for embryonic development. Ogt null Drosophila and mice are embryonic lethal. In human, patients possessing Ogt mutations display shared features, including severe intellectual disability, developmental delay, ataxia, microcephaly, etc. So far, we still don’t know which O-GlcNAcylation events are critical for development and what are the underlying molecular mechanisms, partially due to lack of effective detecting and intervening approaches. Here we propose to develop new methods to precisely label this highly-dynamic posttranslational modification, and to remove O-GlcNAc modifications in a locus-specific manner. We will use these new techniques to dissect the dynamic properties of O-GlcNAcylation and decipher the molecular mechanisms of O-GlcNAc modifications in regulating embryogenesis. We expect that the completion of this research project will build a world-class research team on O-GlcNAcylation, and help us better understand the molecular basis of O-GlcNAc related human diseases.

O-GlcNAc糖基化是发生于蛋白质丝、苏氨酸残基上的动态可逆的单糖修饰，作为细胞内一种重要的营养感受机制，参与调控信号转导、基因转录、和新陈代谢等众多生物学过程。细胞内O-GlcNAc糖基化的水平由两种互相拮抗的酶OGT和OGA所维持，其动态平衡对胚胎发育至关重要。果蝇和小鼠中OGT的功能缺失引起早期胚胎致死，人类OGT基因突变与小儿智力发育障碍相关。由于针对蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰的时空动态检测和干预手段的缺乏，目前对其调控胚胎发育的关键底物和具体分子机制尚不完全明确。本项目拟开发动态标记蛋白质O-GlcNAc糖基化的新方法以及靶向去O-GlcNAc糖基化的新策略，利用这些新手段解析O-GlcNAc糖基化在早期胚胎发育过程中的动态特征和作用机制。该项目将打造一支具有国际影响力的蛋白质O-GlcNAc糖基化的研究队伍，为与此相关的人类重大疾病的诊断和防治提供科学技术储备。

O-GlcNAc糖基化是发生于蛋白质丝、苏氨酸残基上动态可逆的单糖修饰，作为细胞内一种重要的营养感受机制，参与调控信号转导、基因转录和新陈代谢等众多生物学过程。但是目前对O-GlcNAc糖基化调控胚胎发育的分子机制尚不明确。在本项目的资助下，我们开发了新型O-GlcNAc糖基化荧光探针Halo-CpOGACD，并且在固定细胞、果蝇三期幼虫唾液腺多线染色体以及活体胚胎中进行验证，证明了Halo-CpOGACD识别O-GlcNAc修饰底物的有效性和特异性。随后，我们利用这一探针绘制了O-GlcNAc糖基化修饰在早期胚胎发育过程中的动态分布图谱；解析了O-GlcNAc糖基化水平降低导致早期胚胎神经系统发育相关基因转录抑制的分子机制，为进一步研究糖基化水平异常导致小儿智力发育障碍的分子机制打下基础。.在完成项目既定研究内容后，我们扩展开发了利用生物素富集检测O-GlcNAc糖基化底物的新方法，并对293T细胞中的O-GlcNAc糖基化修饰底物进行了富集分析，结果显示富集指数靠前的绝大多数蛋白为已知的高可信度的O-GlcNAc糖基化蛋白，此外我们还鉴定出许多之前未报道的O-GlcNAc糖基化蛋白，极大地丰富了细胞的O-GlcNAc糖基化蛋白组。为了进一步探索维持机体O-GlcNAc糖基化修饰水平的具体机制，我们联合利用流式细胞术和CRISPR/cas9全基因组筛选技术，筛选与验证了细胞内参与O-GlcNAc糖基化水平调控的关键因子，解析了SCF复合物关键成员FBXO31参与调节O-GlcNAc糖基化修饰的分子机制。在本项目的资助下，我们已经在国际知名期刊Cell Reports、PLOS Biology和FEBS Journal发表3篇文章，另外3篇文章也在整理投稿中，并已申请国家发明专利1项。