留兰香香蜂草苷对肝纤维化内质网应激--自噬通路的调控作用机制

There is a close relationship between endoplasmic reticulum stress (ERS) and autophagy, which plays a crucial role in hepatic fiboris. In our previous studies, we found that didymin significantly ameliorated hepatic fibrosis. And our latest pilot experiment showed that didymin not only inhibited the expression of ERS related proteins such as CHOP and GRP78, but also decreased the level of autophagy related proteins including Beclin1, LC3 II/I and Atg5 in liver cells, suggesting that the anti-fibrosis of didymin may be ascribed to the regulation of the ERS-autophagy pathway. But so far, its exact mechanism remains unclear. Thus, in the present study, the ERS model and autophagy model in hepatic stellate cells (HSCs) will be firstly induced by thapsigargin and rapamycin, respectively. And then the effects of didymin on ERS and autophagy will be investigated. Moreover, tunicamycin will be used to stimulate HSCs, and the effect of didymin on the ERS-autophagy pathway will be further studied. In addition, hepatic fibrosis will be induced by CCl4 in rats, and the effects of didymin on the ERS-autophagy pathway will also be investigated. To sum up, this study will target the ERS-autophagy pathway to investigate the protective mechanism of didymin on hepatic fibrosis, providing the experimental evidence for the treatment of hepatic fibrosis.

内质网应激(ERS)和自噬之间存在着密切的相互调节关系，在肝纤维化发生过程中发挥重要作用。前期，我们实验发现香蜂草苷能明显改善肝纤维化；近期的试验则表明其可抑制ERS相关的CHOP、GRP78的表达，同时能下调自噬蛋白Beclin1、LC3 II/I、Atg5的水平，提示，其抗肝纤维化的作用机制可能与调控ERS-自噬通路有关，但确切机制尚未清楚。为此，本项目拟分别采用毒胡萝卜素和Rapamycin诱导HSCs，建立ERS、自噬模型，分析香蜂草苷对ERS及自噬的调节作用机制；采用衣霉素刺激HSCs引起内质网应激-自噬连锁反应，进一步分析其对HSCs内质网应激-自噬通路的影响；同时，用CCl4制备大鼠肝纤维化模型，在动物水平研究其对肝细胞内质网应激和自噬通路的影响。本研究将以HSCs为靶向，内质网应激-自噬通路为切入点，深入探讨香蜂草苷抗肝纤维化的作用机制，为其治疗肝纤维化提供前期研究基础。

本项的目的是研究香蜂草苷减轻肝损伤、肝纤维化的作用及其机制。细胞实验主要检测香蜂草苷（didymin）对肝星状细胞（HSCs）增殖、凋亡、自噬小体的影响，同时，深入研究内质网应激和自噬相关通路，并使用siRNA沉默 Atg7制备HSCs自噬模型。结果表明，香蜂草苷可以显著抑制HSCs增殖、活化和集落形成；能够通过抑制炎症相关蛋白的表达，减轻炎症反应；另外，能明显抑制HSCs活化，促进HSCs细胞凋亡、减轻胶原沉积，减少自噬小体生成；进一步的研究发现，香蜂草苷能抑制GRP78表达，并能抑制Caspase、PERK/eIF2α和IRE1/JNK通路的活化，提示对HSCs内质网应激有抑制作用；此外，能明显减少自噬小体形成、阻断mTOR 和AMPK 通路，表明对HSCs 自噬也有明显的抑制作用。体内实验采用CCl4复制肝纤维化实验模型研究香蜂草苷对肝纤维化的保护作用。生物信息学和转录组学分析表明香蜂草苷抗纤维化作用的可能靶点主要包括内质网应激、代谢通路、PI3K/AKT通路等；此外，结合代谢组学分析发现香蜂草苷通过调节靶基因LPCAT1、LPCAT3、LPIN1等的表达来减少磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱的合成，继而抑制甘油磷脂代谢通路、减轻脂毒性引起的肝细胞损伤；而药效学和分子生物学实验发现香蜂草苷能明显减轻小鼠肝损伤和肝细胞凋亡，并显著减少胶原的生成和沉积；进一步的机制研究表明香蜂草苷能明显抑制GRP78、p-PERK、p-eIF2α、p-IRE1α、ATF6、XBP1、CHOP和p-JNK的表达，提示，其能显著减轻内质网应激；另外，香蜂草苷尚能减少自噬小体数量、抑制LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg-5和Beclin-1表达，表明，其对肝细胞自噬有抑制作用。另外，为了比较全面地了解香蜂草苷的保肝作用，本项目还探讨了香蜂草苷对化学性和药物性肝损伤的作用。实验结果表明，香蜂草苷能明显减轻LPS/D-Gal引起的急性肝损伤，其机制与抑制PI3K/Akt、TLR4/NF-κB信号通路和甘油磷脂代谢通路有关；类似的，香蜂草苷可能通过抑制TLR4/NF-κB和PI3K/Akt信号通路减轻地塞米松引起的脂肪性肝损伤。总之，细胞和动物实验表明，香蜂草苷明显减轻肝损伤、肝纤维化，其机制可能与减轻肝细胞内质网应激/自噬，以及抑制PI3K/Akt、TLR4/NF-κB信号通路和甘油磷脂代谢通路有关。