基于内质网应激的β-榄香烯干预NSCLC细胞的自噬稳态平衡作用及机制研究

Autophagic homeostasis is an important mechanism for survival of lung cancer cells，and endoplasmic reticulum stress (ERS) is one of the potent factors for autophagic homeostasis. β-elemene is a major terpenoid compound of Chinese herbal medicine Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling, with a potential anti-cancer activity. The pre-results of research group in this project showed that β-elemene could regulate ERS-mediated autophagy of non-small cell lung cancer (NSCLC) A549 cells, however, its underlying mechanism remains unknown. On the basis of our previous studies, we proposed a scientific hypothesis on “Inhibition of β-elemene on proliferation of NSCLC cells might be related closely with regulating ERS-mediated autophagy”. In this study, we intend to use transmission electron microscopy, Western blotting, RT-PCR, immunohistochemistry, siRNA, GFP-LC3 single fluorescence system/mRFP-GFP-LC3 double fluorescent systems, tool molecules and other technologies to study the regulation of β-elemene on ERS features and autophagic homeostasis changes of NSCLC cells; to analyze correlation of ERS, autophagy homeostasis, cell survival combined with mathematical statistics, and to screen related targets; to further research the possible signal pathway. This study ultimately reveals the effect and mechanism of β-elemene on autophagy of NSCLC cells, and provides a new strategy and new targets for the intervention and treatment of NSCLC. The project has an important theoretical and practical significance for the in-depth understanding of the intervention mechanism of β-elemene on NSCLC and promotes innovation and development of new drugs for NSCLC.

肺癌细胞的自噬稳态平衡是其存活的重要机制，而内质网应激（ERS）是自噬稳态平衡的强诱导因素。β-榄香烯是温郁金的主要萜烯类化合物，课题组前期研究发现它通过调控非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞ERS诱导自噬，但机制未明。我们提出“β-榄香烯抑制NSCLC细胞增殖与其干预、调控ERS介导自噬作用相关”的科学假说。拟采用透射电镜、Western blotting、RT-PCR、免疫组化、siRNA、GFP-LC3单荧光体系/mRFP-GFP-LC3双荧光体系、工具药物等技术研究β-榄香烯调控NSCLC细胞ERS和自噬特征变化，分析ERS、自噬稳态、细胞存活之间的关联，筛选相关靶标研究可能信号途径，揭示β-榄香烯调控NSCLC细胞自噬稳态平衡作用及其机制，为干预、治疗肺癌提供新的策略和靶点。本研究对深入理解β-榄香烯干预肺癌的作用机理和推动肺癌创新中药新药的研发具有重要理论价值和实际意义。

非小细胞肺癌（NSCLC）是我国发病率最高的恶性肿瘤，细胞自噬稳态平衡在其发生、发展过程中发挥了重要作用，通过内质网应激（ERS）调控自噬具有潜在治疗肺癌的前景。从姜科植物温郁金中提取的萜烯类化合物β-榄香烯有广泛的抗肿瘤作用，前期研究发现它可以杀伤包括肺癌细胞在内的多种肿瘤细胞，诱导肺癌细胞自噬，引起肺癌细胞凋亡。本研究首先通过MTT和活体Micro-CT成像考察了β-榄香烯的体外和体内抗肺癌细胞的作用，证实它能抑制肺癌A549细胞的增殖和荷肺癌小鼠Lewis C57BL/6J肿瘤的生长，而ERS抑制剂4-PBA可抑制β-榄香烯的抗肿瘤作用；进一步用Westernblot、免疫组化和PCR等检测体内外细胞标本，发现β-榄香烯上调了ERS相关蛋白CHOP、PERK、IRE1α、ATF6和ATF4的表达及mRNA的转录，ERS抑制剂干预后，上述蛋白表达和mRNA转录水平均明显下调；上述实验证明β-榄香烯通过调控ERS抑制肺癌生长。然后应用溴乙锭（EB）/吖啶橙（AO）染色、透射电镜和mRFP-GFP-LC3双荧光体系三种研究手段，从形态学上观察到β-榄香烯诱导肺癌A549细胞的自噬，加入ERS抑制剂后自噬受到抑制；流式细胞术检测发现ERS抑制剂减少了β-榄香烯诱导的A549细胞的凋亡；荧光显微镜观察β-榄香烯诱导A549细胞活性氧（ROS）的产生，加入ERS抑制剂亦可抑制ROS；Westernblot检测发现β-榄香烯上调了ERS途径关键蛋白PERK、IRE1α、ATF6和自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1、LC3、P62的表达；上述实验表明β-榄香烯通过调控ERS干预肺癌细胞自噬发挥抗肺肿瘤作用，并筛选出IRE1α和JNK作为潜在作用靶点。最后应用工具药物（IRE1α抑制剂STF-083010和JNK抑制剂SP600125）和siRNA基因沉默（沉默了IRE1α和JNK基因）两种技术手段，确证β-榄香烯通过干预IRE1α-JNK信号通路调控肺癌细胞自噬稳态平衡。本课题阐明了β-榄香烯在通过IRE1α-JNK信号通路调节肺癌细胞自噬平衡中的作用，揭示了β-榄香烯抗肺癌作用的新机制，有利于深入开发创新中药。