听毛细胞MLCK基因特异性敲除小鼠的听力学机制研究

听力障碍与毛细胞的骨架相关分子密切相关,毛细胞骨架结构的调控机制可能参与了听觉信号的传导。我们前期研究发现在小鼠听觉毛细胞中特异性敲除肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, MLCK)基因可导致听力下降。为系统研究MLCK在毛细胞中的作用机制，本项目将首先利用基因敲除技术建立在内、外毛细胞中特异性敲除MLCK 基因的动物模型, 然后通过分析敲除小鼠的听力表型，研究毛细胞骨架结构变化规律、F-actin动力学改变规律、细胞骨架相关信号分子的激活状态，并通过挽救实验最终阐明MLCK调节毛细胞骨架变化的分子信号机制。本研究的完成将为听觉信号传导通路提出一条新的生理调节机制,同时亦将为听力障碍疾病的防治提供新的研究途径。

本项目初步研究了听力障碍与毛细胞的骨架调节分子肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, MLCK)之间的关系，分别研究了特异性敲除耳蜗内、外毛细胞MLCK基因小鼠动物模型的听力、耳蜗形态学及毛细胞骨架变化规律、F-actin动力学改变规律及轻链磷酸化水平，推断MLCK 可能通过影响F-actin 的聚合来调控胞膜张力，从而实现在听觉系统中的作用。完成的主要研究内容和结果有：1）分析了MLCK蛋白及mRNA在小鼠毛细胞主要表达短型MLCK（S-MLCK），主要集中在胞质区域；2）获得了遗传背景单一的内、外毛细胞特异性敲除MLCK小鼠的模型；3）通过对敲除小鼠的听力测试，发现敲除内、外毛细胞的MLCK小鼠的听力较对照小鼠较差；4）对敲除小鼠耳蜗的显微观察发现MLCKIKO小鼠IHCs的表皮板表面出现了空泡状的结构，且纤毛束旁出现了许多球状结构，MLCKOKO小鼠顶转OHCs的静纤毛出现缺失、形态异常、静纤毛束分散等现象；5）通过对分离的MLCKIKO小鼠的IHCs进行低渗溶液刺激试验，发现MLCKIKO小鼠的IHC对低渗盐溶液刺激更敏感，其膜张力明显低于正常小鼠，此外MLCKOKO小鼠的OHCs的直径较对照小鼠明显增大；6）MLCKIKO小鼠、MLCKOKO小鼠毛细胞的F-actin含量较对照小鼠均降低；7）MLCKIKO小鼠、MLCKOKO小鼠的IHCs和OHCs中的轻链磷酸化水平较对照小鼠均有降低。