Pou4f3基因突变小鼠的模型建立及听力学机制研究

Due to the hereditary deafness clinical samples were extremely difficult to obtain, and the pathological process s is also very little understood, thereby the innovation of the treatment method is hampered. Mutation in human POU4F3 gene could lead to inherited progressive hearing loss (DFNA15), one of the common dominant inherited diseases and the treatment and pathological process of it is still not clear. Given the high conservation of POU4F3 between human and mice, here for the first time, we established POU4F3 gene mutation mice which is the first DFNA15 type deafness research disease models in the world. Our previous study indicates that hearing behavior of this model is very similar to clinical manifestation of patients, which confirmed the gene-phenotype relationship between DFNA15 and POU4F3. Based on this, we will study the hearing process and regularity of pathological changes of DFNA15 in this mice model through the audiology, pathology, biochemistry and molecular biology methods, Systemic analysis. We will explore the disease intervention methods based on the above results. Our study will provide important experimental evidence, at the same time provides the new method for the clinical treatment of the disease.

由于遗传性耳聋极难获得临床样本，人们对其病理过程的认识亦非常少，从而阻碍了治疗方法的发现。DFNA15非综合征性语后聋是由POU4F3突变引起的常见性耳聋，但至今人们仍无法了解该疾病的临床病理全过程，亦无有效的预防及对因治疗方法。我们利用小鼠POU4F3基因与人POU4F3基因的高保守性，完全模拟人POU4F3的基因突变，建立了小鼠POU4F3突变的基因敲入动物，在国际上首次建立DFNA15型耳聋研究的小鼠疾病模型。前期研究证实：该小鼠的听力行为与人临床表现十分相似，由此确证了DFNA15与POU4F3的基因-表型关系。本课题将在此基础上通过听力学、病理学、生化学和分子生物学等手段，系统分析小鼠DNA15听力病理改变的过程和规律、研究其分子机制，根据以上研究结果初步探索该疾病的药物干预。本课题的完成将为认识DFNA15耳聋疾病的病理过程提供重要的实验证据，同时为该疾病的临床治疗提供新思路。

POU4F3基因突变可引起人类DFNA15非综合征型遗传性耳聋，是临床较为常见的渐进性语后聋。目前该疾病的临床病理机制仍不清楚，亦无有效的预防及靶向性疗法。本课题完全模拟首次发现的犹太裔DFNA15耳聋家系的基因突变序列构建Pou4f3突变小鼠模型，明确DFNA15遗传性聋的病理组织学及分子生物学发病机制，为该种疾病的防治及临床药物疗法奠定实验研究基础。利用转基因敲入技术构建Pou4f3第二个外显子末尾8个碱基对缺失的突变小鼠，纯化背景后经基因型鉴定明确三种基因型小鼠（纯合突变型Pou4f3Δ/Δ、杂合突变型Pou4f3Δ/+及野生型对照Pou4f3+/+）进行了一般外观及行为学观察、听功能及前庭功能检测、内耳组织病理学分析、下游靶基因的检测及应用突变后正调控的靶基因拮抗剂药物进行治疗研究。在前期对5周至17月龄小鼠行听功能检测的基础上又主要分析了Ⅰ波幅值的变化比较及听功能随年龄变化同人类进行趋势比较；完善小鼠的内耳组织学病理表型分析。应用免疫荧光及免疫印迹方法完善内耳组织下游基因的蛋白水平检测。同时依据其分子致病机制，进行了靶向性药物的动物研究，分析给药前后的听功能及内耳组织分子生物学变化。将小鼠ABR阈值与DFNA15犹太裔H耳聋家系种的患者临床资料对比，结果显示：Pou4f3Δ/+小鼠随着年龄增长，ABR阈值呈进行性缓慢增长，与耳聋家系中患者的纯音测听阈值升高进程基本一致，该听功能检测结果反应本实验中构建的小鼠模型能够比较贴切地模拟人类DFNA15疾病。内耳组织形态学观察可见Pou4f3Δ/+耳蜗内毛细胞静纤毛融合、异常增生延长；外毛细胞局部缺失，纤毛束较正常变稀疏。同时透射电镜中内外毛细胞中均出现线粒体水肿、空泡化现象。我们还检测到Pou4f3Δ/+耳蜗Espin的表达较对照组异常增多。同时应用了Espin的抑制剂行2月龄Pou4f3Δ/+小鼠听力挽救实验，结果显示给予抑制剂后听功能下降减缓，耳蜗组织Espin的表达较对照给药组下降。通过听功能检测，本研究中构建的Pou4f3Δ/+小鼠能够作为人类DFNA15疾病的良好的动物模型有助于对该疾病发病机制及防治疗法的深入研究。研究发现Pou4f3Δ/+小鼠内外毛细胞纤毛及线粒体的形态异常，从而可能影响内外毛细胞对声音处理及传输的功能，导致了渐进性的听力下降，并明确分子生物学机制研究，提出了靶向性药物治疗方法。