菲律宾蛤仔防御素基因家族的多样性及功能分化研究

Antimicrobial peptides (AMPs) are small peptides with broad-spectrum antimicrobial activity. They form an ancient non-specific type of innate immunity found universally in all living organisms and used as the principal first line of defense against the invading pathogen. Presently, most of the research on marine fauna was focused on identification of new AMPs and evaluation of their antimicrobial activities. However, the study on the molecular diversity and functional divergence of AMPs are still in its infancy. It was suggested that diversification of AMPs by accumulation of multiple variations around an originally unique form perhaps provided significant means of acquiring microbial target specificity, concerned in the evolutionary arms race between pathogens and their hosts. To gain insight into the molecular diversity of the defense gene family in Ruditapes philippinarum, we attempt to characterize the sequence variability and elucidate the evolutionary routes leading to such sequence diversification. Antibacterial activity and mechanism of action of defensins will also be compared to elucidate the biological significance of directional evolution on the innate immune system of Manila clam. Additionally, the diversity and composition of the bacterial communities on the skin of the individual clam will be determined via barcoded pyrosequencing of the 16S rRNA gene, and the co-evolution of defensins and microbe will be addressed.

抗菌肽是一类具有广谱抗微生物活性的多肽，被认为是机体固有免疫的第一道防线。目前，海洋动物抗菌肽的研究仍以新型抗菌肽发掘、基因表达与调控、抗菌活性鉴定等内容为主，对抗菌肽基因的多样性和功能分化仍缺乏系统深入的研究。抗菌肽的分子多样性被认为是生物体的一种适应性进化机制，可使机体能够更好地适应环境和抵抗病原的侵袭。本研究以菲律宾蛤仔为研究对象，通过开展防御素基因家族的多样性和功能分化研究，解析不同亚型防御素分子的作用机制，阐释防御素基因家族的功能分化对机体固有免疫的影响途径；结合进化分析，探明菲律宾蛤仔体表微生物群落对防御素基因家族进化的驱动作用，为揭示防御素家族的分子进化机制提供科学依据。

抗菌肽被认为是机体固有免疫的第一道防线，在复杂漫长的生物进化过程中发挥着基础而重要的作用。目前，对海洋动物来源抗菌肽的研究仍聚焦于新型抗菌肽发掘、基因表达与调控、抗菌活性鉴定等内容，对抗菌肽分子多样性及其功能分化尚缺乏深入的研究。本研究以菲律宾蛤仔为研究对象，结合免疫组化、原位杂交、流式细胞术、电化学分析和生物信息学等方法，分析了（大）防御素基因的序列多样性，比较了不同亚型（大）防御素的抗菌活性、杀菌动力学作用及其潜在作用机制，并探讨了其免疫调理活性。. 结果发现，菲律宾蛤仔（大）防御素主要分布在免疫相关组织或与外界环境直接接触的组织；其中，Rpdef1、Rpdef2和Rpdef3主要分布于血淋巴细胞中，而Rpdef4主要存在于鳃组织中；VpBDef-1和VpBDef-2分别主要存在于肝胰腺和鳃组织上皮细胞中。在杀菌机制方面，发现防御素家族的几种亚型主要通过破坏细胞膜来发挥作用；而大防御素则存在两种杀菌机制，即VpBDef-2主要通过破坏细胞膜发挥作用，而VpBDef-1对细胞膜的破坏作用较低，其可穿过细胞膜与细菌核酸结合，从而发挥杀菌作用。此外，菲律宾蛤仔（大）防御素还表现出促进血淋巴细胞吞噬和迁移等调理作用，提示其可通过调理活性参与机体的细胞免疫应答反应。进化压力分析发现，菲律宾蛤仔防御素在进化过程中受到正向选择，正向选择的位点通常位于C端，这些氨基酸的变化可能会影响防御素与细胞膜的结合能力，进而可能导致抗菌活性或作用方式的改变。上述研究结果初步揭示了菲律宾蛤仔不同亚型（大）防御素分子的作用途径和功能分化，为深入探讨软体动物抗菌肽的分子进化机制提供了科学依据。