RhoA信号通路和细胞骨架在猪伪狂犬病毒感染中的作用和机制研究

The porcine pseudorabies virus causes severe economic lost to the swine industry worldwide. Research on the molecular mechanism of PRV infection and replication in the host cells is inadequate. In this project, we firstly characterize the function of RhoA and its effectors in the PRV life cycle by gene knockout and gene over-expression strategy and chemical drug treatment. Besides, we construct the recombinant GFP-PRV and the cytoskeleton gene-reporter gene plasmid, then analyze the dynamic interaction between the GFP-PRV particle and the host cytoskeleton by immunofluorescence and live-cell imaging. In additional, we investigate the effects of RhoA disfunction on the actin reorganization and on the microtubule stability and dynamics change by gene knockdown and chemical drug treatment, which would elucidate the synergy function and mechanism of RhoA signal pathway and cytoskeleton in the PRV infection. Our research focused on the interaction between PRV and cell surface receptor-related signal pathway and cytoskeleton of host cells facilitates us to well-understand the mechanism of PRV infection, and offers scientific evidence to PRV prevention.

猪伪狂犬病毒（porcine pseudorabies virus，PRV）严重危害全球生猪产业。国内外对PRV感染宿主细胞的分子机制研究的还不充分。本项目首先利用基因敲除/过表达和化学药物处理的方法，鉴定RhoA及其效应因子在PRV感染各阶段的作用；其次，构建重组GFP-PRV病毒和细胞骨架蛋白基因-荧光报告基因重组质粒，利用免疫荧光技术和活细胞显微成像的方法，解析GFP-PRV病毒粒子与细胞骨架的动态相互作用；最后，利用基因敲除结合化学药物处理的方法，分析RhoA功能异常对细胞骨架微丝和微管组装和动态变化的影响，以及这些变化对PRV增殖的影响，以期阐明RhoA信号通路和细胞骨架在PRV感染过程中的协同作用和调控机制。这些围绕PRV和宿主细胞表面受体和相关信号通路及细胞骨架的相互作用的研究，有助于了解PRV感染的分子细节，从而为PRV感染的防控提供新的理论支持。

猪伪狂犬病毒（porcine pseudorabies virus，PRV）严重危害全球生猪产业。国内外对PRV感染宿主细胞的分子机制研究的还不充分。本项目首先利用化学药物处理PK-15细胞，结果显示RhoA信号通路和细胞骨架蛋白均影响PRV增殖。其次，利用化学药物阻断RhoA功能和siRNA技术抑制RhoA表达，通过qPCR、WB、流式细胞术、免疫荧光技术和病毒滴度测定等多种方法，发现抑制RhoA促进PRV复制；相反地，利用化学激动剂激活RhoA功能或过表达策略增加RhoA表达，均抑制PRV复制。此外，利用免疫荧光技术和激光共聚焦成像的方法，解析RhoA对细胞骨架微丝动态变化的调控作用，发现RhoA通过调控细胞骨架微丝的重排，从而调控PRV复制。最后，利用siRNA技术抑制RhoA表达，增强了PRV吸附和进入宿主细胞；而过表达RhoA减少PRV吸附和进入宿主细胞。结果表明RhoA通过限制病毒吸附和进入宿主细胞从而抑制PRV增殖。这些围绕PRV和宿主细胞相关信号通路及细胞骨架的相互作用的研究，有助于了解PRV感染的分子细节，从而为PRV感染的防控提供新的理论支持。