膜蛋白脂立方相结晶方法研究

膜蛋白与许多重要疾病，如老年痴呆、心血管病、癌症等有直接联系，是大约40%的药物靶点，其结构与功能的研究意义重大，但是膜蛋白由于自身疏水性使得结晶比较困难，在目前解析出的蛋白质结构中，膜蛋白只占1.2%。基于脂立方相的蛋白结晶技术，采用脂立方相模拟生物膜环境，膜蛋白可以在脂质双分子层中相互接触，在合适的条件下形成晶体。本项目研究脂立方相结晶方法，如不同筛选条件、不同的脂对结晶的影响等；研究微量样品结晶技术，提高纳升级样品结晶的成功率和重复性，降低蛋白结晶的费用；建设膜蛋白脂立方相结晶实验平台，以上海光源生物大分子线站配属实验室为基础，增添脂立方相结晶所需的设备，编制实验规程，培训实验人员；对相关目标膜蛋白，如变形菌视紫质pR等展开结晶实验，筛选和优化结晶条件，对获得的晶体进行衍射实验，开展结构与功能研究；研制针对粘性脂立方相样品进行点样的自动化设备，开发高通量结晶平台，提高实验效率。

本项目研究在生命科学中具有重要意义的膜蛋白的脂立方相结晶方法学，并进行相关特定蛋白质的结晶实验研究。在方法学研究中，1）我们首先依托上海光源生物大分子线站配属实验室，购置和研制了相关的膜蛋白脂立方相结晶所需的设备与耗材，建设了结晶实验平台，为后续的研究工作建立了基础；2）我们建立和发展了相关的结晶实验技术，对与脂立方相结晶相关的条件（如去垢剂类型、脂的比例、沉淀液组份、耗材预处理）等做了深入研究，摸索出一套最优的结晶实验方法；3）在原有不具备脂立方相结晶能力的通用结晶机器人的基础上，我们通过增加硬件、修改软件、优化流程，实验了脂立方相结晶实验的自动化，提高了实验效率；4）通过与清华大学、北京大学研究组等的合作，我们在设备、耗材和实验操作等方面提供帮助，推广了脂立方相结晶实验方法；5）针对膜蛋白的脂立方相晶体尺寸较小的问题，我们进行了上海光源、美国APS光源、日本SPring-8光源的晶体学线站在脂立方相晶体衍射实验比较研究，并在SACLA自由电子激光进行了相关实验方法研究；6）针对脂立方相晶体的微聚焦晶体学线站设计与建设，本项目负责人作为蛋白设置（南方）五线六站工程微晶体线站负责人，承担了线站设计与建设任务。在膜蛋白结晶实验研究中，1）进行了有代表性的bR蛋白（视紫红质）的结晶实验工作，获得了有效衍射分辨率的蛋白质晶体，验证了脂立方相结晶实验平台的有效性；2）进行了pR蛋白（变形菌视紫红质）的结晶实验工作，筛选到一些结晶条件，但是衍射效果较差，不能进行后续结构分析；3）进行了AR4蛋白（古细菌视紫红质）的结晶实验工作，没能筛选到有效的结晶条件，目前实验还在继续推进中；4）进行了FucP蛋白（转运蛋白）的结晶实验工作，筛选到一些结晶条件，但是晶体较小，不具备衍射条件；5）进行了MP124（转运蛋白）的结晶实验工作，没能筛选到有效的结晶条件；6）进行了hb1（钾离子通道蛋白）的结晶实验工作，筛选到一些结晶条件，目前实验还在继续推进中。本项目支持在国内外期刊发表4篇学术论文（其中SCI检索2篇）。本项目支持人员参加国内外学术会议6次，参与举办国内学术会议1次，参与邀请国外专家举办学术讲座5次。参与硕士研究生培养4人（其中毕业3人），参与博士后培养1人（在站）。