苯并芘诱发细胞转化过程中聚（ADP-核糖）受体蛋白的筛选与鉴定

聚ADP-核糖基化在苯并芘B(a)P诱发的细胞损伤和恶性转化中起重要作用，而聚ADP-核糖基化过程中存在大量相互作用的PAR受体蛋白，但以何种蛋白作为主要受体蛋白在其中扮演角色，具体调控机制如何，均有待深入阐明。本研究拟应用RNA干扰技术建立人支气管上皮细胞16HBE的PARG基因缺陷细胞株，通过检测B(a)P活性代谢产物BPDE诱导16HBE及其PARG缺陷细胞株转化过程中细胞周期时相、DNA损伤、细胞增殖、PAR的表达变化等指标，探讨PAR在BPDE诱导细胞恶性转化中的作用，以及核糖基化过程与细胞转归之间的时空联系；同时借助蛋白质组学相关技术筛选BPDE诱发细胞转化过程中的PAR受体蛋白，从分子水平上探讨PAR在BPDE处理细胞中所产生的生物效应，为研究PAR参与BPDE引起细胞恶性转化的分子机制和寻找B(a)P致癌过程中早期敏感的生物标志物提供理论依据，为化学致癌的防治提供新的思路。

苯并芘【benzo（a）pyrene，BaP】是多环芳烃类（PAHs）中毒性最大的一种强烈致癌物，聚-ADP-核糖基化在BaP诱发的细胞损伤和恶性转化中起重要作用，而具体作用机制如何有待深入阐明。为了更好、更全面地了解ADP-核糖基化反应在BaP诱导细胞损伤过程中的作用，本研究首先应用RNA干扰技术建立人支气管上皮细胞16HBE的PARG基因缺陷细胞株，RT-PCR及western blot检测显示最终选定的缺陷细胞株干扰效率达80%以上，效果显著（P<0.05）；且缺陷细胞株的生长周期未见明显变化（与正常细胞相比，P>0.05）。进一步利用PARG基因缺陷细胞和正常的16HBE细胞作为研究对象，使用0 µmol/L、5 µmol/L、10 µmol/L、20 µmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的BaP进行染毒，发现BaP作用后，shPARG细胞的存活较正常16HBE细胞多，当作用剂量达到40 µmol/L时，两者之间的差异经统计学分析存在明显差异（P<0.05）；shPARG细胞内ATP消耗较16HBE细胞减少，且当作用剂量达到40 µmol/L时，两者之间的差异具有统计学意义（P<0.05）；正常16HBE细胞随BaP染毒剂量的增加DNA损伤程度逐渐加重，而shPARG细胞内的DNA损伤程度明显减轻，在BaP作用剂量达到20 μmol/L时，两种细胞之间的DNA损伤差异具有显著性（P<0.05）。同时借助免疫共沉淀技术和蛋白质组学研究相关技术对可能发生聚-ADP-核糖基化的蛋白进行筛选，分析聚-ADP-核糖基结合蛋白相互作用序列的特征：共鉴定出12种特异性PAR相互作用蛋白，其中包括有组蛋白和微管蛋白，这些蛋白大多具有与PAR结合的特定序列，且碱性氨基酸（H/K/R）与疏水性氨基酸在蛋白中遵循一定规律出现。通过本项目的研究，我们推测组蛋白的ADP-核糖基化在BaP致癌过程中发挥重要的调节作用，这将为化学致癌的防治提供新的参考依据。