聚ADP-核糖聚合酶1调控高迁移率族蛋白1细胞内定位的机制及意义研究

非组蛋白核蛋白高迁移率族蛋白1（HMGB1）在细胞外是一种晚期炎症因子，在脓毒症和重症急性胰腺炎等疾病的进展中发挥十分重要的作用，是炎症调控的关键因子。炎症细胞分泌HMGB1经过了由胞核向胞浆移位，再由分泌型溶酶体向细胞外转运的过程。其中，向胞浆移位是最为关键的步骤。我们的前期研究显示，聚ADP-核糖聚合酶1（PARP-1）活化在脂多糖（LPS）激活的小鼠巨噬细胞主动分泌HMGB1的过程中发挥了关键性调控作用。本项目拟采用酶学、分子生物学、细胞生物学、分子免疫学和基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）等方法从分子、细胞和在体三个层面探讨HMGB1蛋白ADP-核糖基化修饰对其乙酰化和细胞内定位的影响以及PARP-1对乙酰化酶CBP/P300活性的影响等，以期阐明PARP-1影响HMGB1细胞内定位的机制，为PARP-1抑制剂调控HMGB1分泌的抗炎治疗策略提供理论依据。

目的：探讨PARP-1在LPS 诱导的巨噬细胞HMGB1释放中的作用及其机制。.方法：观察LPS诱导的巨噬细胞内PARP-1活性变化的时间规律。观察PARP抑制剂3-AB或PARP-1基因沉默对巨噬细胞培养液上清和细胞内HMGB1的定位的影响。观察3-AB或PARP-1沉默对LPS诱导的巨噬细胞内HMGB1的核糖基化和乙酰化修饰的影响，以及对细胞内HAT和HDAC活性的影响。自PARP-1基因敲除鼠分离BMDM，验证上述结果。体外构建聚ADP核糖基化反应体系和乙酰化反应体系，以PARP-1对HMGB1进行聚ADP-核糖基化修饰；然后再以PCAF、CBP和P300对上述产物进行进一步的乙酰化反应，探讨聚ADP-核糖基化修饰对其乙酰化修饰的影响。观察ROS清除剂NAC、MAPKs抑制剂对LPS诱导的PARP激活和HMGB1释放的影响。腹腔注射LPS制作小鼠脓毒症模型。比较PARP-1+/+小鼠和PARP-1-/-小鼠血清HMGB1水平和死亡率。观察NAC、JNK抑制剂和3-AB对脓毒症小鼠血清HMGB1水平和死亡率的影响。.结果：LPS 刺激后巨噬细胞PARP活性升高，4小时可达到高峰。3-AB和PARP-1 基因沉默可以抑制LPS诱导的HAT/HDAC活性比升高、HMGB1的ADP核糖基化和乙酰化修饰，抑制HMGB1核浆移位和释放。在PARP-1-/- BMDM中表达PARP-1可逆转上述变化。HMGB1在ADP核糖基化修饰之后， PCAF、CBP、P300所催化的HMGB1乙酰化水平均明显增强。NAC抑制LPS诱导的巨噬细胞PARP的激活、HMGB1的核浆移位和释放。p38MAPK、JNK和ERK的抑制剂中，只有JNK抑制剂SP600125能阻断PARP-1的激活。NAC可抑制LPS诱导的JNK激活和HMGB1释放。3-AB、NAC、SP600125和PARP-1基因敲除均能下调血清HMGB1水平，降低小鼠死亡率。.结论：LPS通过ROS活化JNK信号，激活PARP-1，使巨噬细胞内HAT/HDAC的平衡向乙酰化倾斜，进而导致HMGB1乙酰化，并向胞浆移位和向胞外释放。PARP-1同时可以对HMGB1进行ADP核糖基化修饰，从而进一步促进HMGB1的乙酰化。阻断ROS/JNK/ PARP-1通路可下调脓毒症小鼠血清HMGB1水平，降低小鼠死亡率。