电子歧化转氢酶NfnAB的分子进化及结构与功能关系的研究

Flavin-based electron bifurcation is recently discovered as a new type of energy conservation in anaerobic bacteria and archaea, which is thought to occupy an important place in the early evolution of life on Earth. This type of enzymes play key role in the energy metabolism of anaerobes and couple an exergonic redox reaction with an endergonic redox reaction. However, the novel mechanism is still not well understood. In our previous study, a novel electron-bifurcating ferredoxin-dependent transhydrogenase (NfnAB) was firstly found in Clostridium kluyveri and Moorella thermoacetica and its biochemical properties and function was well characterized. Moreover, we successfully crystallized the recombinant NfnAB from Thermotoga maritima and solved its primary crystal structure. In this proposal, we plan to investigate the molecular evolution of NfnAB, to make mutations of key amino acid residues of the enzyme, and to solve the crystal structure of the mutants to elucidate the relationship of structure and function. This study will provide for the first time the structural evidences and new insights for the novel flavin-based electron bifurcation mechanism.

“基于黄素的电子歧化”是近年在厌氧细菌和古菌中发现的一种新型节能方式，被认为在生物产能的早期进化上有重要地位。电子歧化酶在厌氧菌能量代谢中起着至关重要的作用，催化偶联一个放能反应推动一个吸能反应，但歧化机理尚不清楚。申请人前期在国际上首次发现了克氏梭菌和Moorella thermoacetica中新型电子歧化酶“铁氧还蛋白依赖的转氢酶NfnAB”，详细研究了其生化性质和功能，对Thermotoga maritima的NfnAB蛋白成功结晶并初步解析结构。本申请项目拟进一步分析NfnAB在厌氧微生物中的分子进化，并结合前期晶体结构解析结果，通过关键氨基酸突变、活性检测、突变体结晶和结构解析，研究其结构和功能的关系。本研究将首次为 “基于黄素的电子歧化”机制的阐释提供较全面的结构证据和更深入的认识。

“基于黄素的电子歧化”是近来在厌氧微生物中发现的一种新的节能方式，在能量代谢中起着重要作用。NfnAB是首先在克氏梭菌中发现的新型电子歧化酶，除节能外还能维持胞内氧化还原平衡。该酶结构简单，能异源表达，成为研究电子歧化机制的理想材料。申请人在与合作者解析Thermotoga maritima的NfnAB蛋白晶体结构的基础上，系统调查了NfnAB在微生物中的分布和进化，发现NfnAB广泛存在于厌氧微生物中，包括厚壁菌门的梭菌纲，拟杆菌门的拟杆菌纲，热袍菌门，梭杆菌门，变形菌门的δ-变形菌纲，螺旋菌门，网团菌门，绿弯菌门以及广古菌门的产甲烷古菌和嗜热古菌等500余种严格厌氧菌；其编码基因排列比较保守，nfnA位于nfnB的上游，位于同一个转录单元，在有些基因组中两个基因还存在重叠现象，还有一些细菌中两个基因融合为一个基因，在一些微生物中存在两个或三个拷贝；进化上Nfn蛋白序列非常保守，保守位点集中在辅因子如FAD和铁硫簇的结合域以及底物结合位点附近；进化分析显示Nfn的进化与菌株分类基本一致，说明Nfn主要通过垂直传递进化；也有例外，热袍菌门的Nfn在进化上与古菌更接近，拟杆菌门的Rikenellaceae科的Nfn位于厚壁菌门的一个分支上，在厌氧真核原生生物Giardia lamblia中也发现有Nfn，与M. themoacetica的Nfn一致性达49%，说明Nfn在进化过程中也发生过基因水平转移。结合前期结构解析结果，对位于NfnB上可能起到电子歧化作用的FAD附近的氨基酸进行突变，结果显示，182位和234位的Gly突变对酶活产生了最大影响，它们对FAD的结合起着关键作用；Arg187和Asp293突变体的酶活明显下降，前者的胍基与FAD的N5和O4结合，具有稳定氧化态的FAD的作用，而后者通过盐桥固定Arg187的胍基，说明二者尤其是Arg187对电子传递起关键作用；而与异咯嗪环的另一个电子接受位点N1有相互作用Val89、Thr440和Val441三个位点的突变，对酶活也有一定的影响，说明这一位点的氧化还原电势对于酶的电子传递也有一定的作用。对上述部分关键突变体进行了结晶尝试，目前正在优化中，期望通过结构解析深入研究其结构和功能的关系。本项目研究结果提高了人们对NfnAB的认识，为 “电子歧化”机制的阐释提供了进一步的实验证据。