WRKY 转录因子在喜树碱生物合成中的调控作用研究

Camptothecin (CPT) and derivatives are good natural plant anti-tumor drugs approved by the FDA for treatment of refractory ovarian and colorectal cancer with rapidly increasing clinical need. Much progress has been made in isolation of genes involved in camptothecin biosynthesis pathway, but regulation mechanism of camptothecin synthesis is not clear..Here, this work aims to study the function of WRKY transcription factors on regulating camptothecin biosynthesis in CPT-producing plant Ophiorrhiza pumila. On the basis of optimization of genetic transformation system and isolation of promoters of some key genes such as STR，TDC，CPR，SLS which were involved in camptothecin biosynthesis, this project intend to screen candidate WRKY through analyzing the correlation of CPT pathway genes expression levels and the alkaloid accumulation. The Yeast one-hybrid and EMSA will be performed to test binding activities between WRKY TFs and the promoter of the CPT biosynthesis pathway genes. Finally, the overexpression and RNAi hairy root lines will be obtained, to identify the function of WRKY TFs and the relationship of WRKY and camptothecin accumulation in vivo. It will lay a basis for understanding regulation mechanism of camptothecin metabolism and enhancement of CPT production by metabolic engineering in the future.

喜树碱类药物是经美国FDA认证的目前最有效的天然抗癌药物之一，广泛用于多种恶性肿瘤的治疗，市场需求巨大。喜树碱生物合成相关催化酶基因功能研究已有较好进展，但有关喜树碱生物合成的转录调控机制未见报道。.本项目拟开展WRKY转录因子在喜树碱生物合成中的调控作用研究。以产喜树碱的草本植物—短小蛇根草为材料，在优化蛇根草遗传转化体系和克隆喜树碱生物合成相关基因启动子等的基础上，分离鉴定与喜树碱生物合成途径中STR，TDC，CPR，SLS 等功能基因表达协同作用的WRKY；通过酵母单杂交和EMSA分析WRKY与STR，TDC，CPR，SLS 等基因的启动子结合活性；并通过转基因手段在短小蛇根草发根中进行正义过表达和RNAi基因敲除，分析WKRY对喜树碱合成相关基因的转录表达和喜树碱等物质积累的影响，解析WKRY对喜树碱生物合成的调控作用，从而阐明WRKY转录因子调控喜树碱生物合成的分子机制。

喜树碱是目前最有效的天然抗癌药物之一，但资源植物中的喜树碱含量低制约了其临床应用。本项目以产喜树碱的草本植物短小蛇根草为研究对象, 分离克隆了5 条全长WKRY 转录因子即OpWRKY1, OpWRKY2，OpWRKY3，OpWRKY5和OpWRKY33，并进行了特性分析及功能鉴定。利用转基因手段完成了该5条WRKY 基因在喜树碱生物合成中的作用分析，重点研究了前3条WRKY转录因子即OpWRKY1, OpWRKY2及OpWRKY3调控喜树碱代谢合成的作用机制。鉴定了OpWRKY1作为喜树碱生物合成的负调控因子，通过Dual-luc及Y1H等实验证明其可结合OpCPR基因启动子的W-box结构域，抑制OpCPR的表达，进而抑制喜树碱的生物合成；鉴定了OpWRKY2具有正调控喜树碱生物合成的功能，利用酵母单杂、Dual-Luc及EMSA等实验验证其直接作用靶点为OpTDC; 鉴定了OpWRKY3主要参与短小蛇根草毛状根的生长，可调节喜树碱合成前体马钱子苷和开环马钱子苷的积累，从而一定程度促进喜树碱的生物合成；过表达OpWRKY5对喜树碱生物合成有抑制作用，而过表达OpWRKY33则明显提高毛状根中喜树碱。以上结果表明不同WKRY因子对喜树碱代谢合成的调控方式和效果各异。同时利用差异转录组结合CRISPR-Cas9基因编辑技术，发现敲除OpG10H和OpSLS可显著降低喜树碱的生物合成，继而通过代谢工程策略在毛状根中单独或共表达OpG10H和OpSLS基因，均获得喜树碱明显高产的毛状根株系。克隆鉴定了一条新TDC成员OpTDC2，体外酶催化反应发现其同样可催化色氨酸脱羧形成色胺，具有对底物亲和力强及催化效率高等特点；还体外酶促反应验证了OpSTR等的体外催化功能。在项目资助下发表SCI期刊论文25篇（单篇最高IF为9.043），申请发明专利4项，培养研究生5名等；本项目的实施，不但阐明了不同WRKY转录因子等调控喜树碱生物合成的分子机理，而且为开展喜树碱代谢工程育种研究提供了多条功能基因和科学依据，具有重要的理论和实践意义。