短小蛇根草中bHLH转录因子调控喜树碱合成的机制

Campothecin was widely used to treat cancer in clinic. Ophiorrhiza pumila with so many advantages is also a potential plant resource for research of molecular mechanism and metabolic engineering. After analysis of transcriptome in O. plumia, 17 new gene encoding key enzyme involved in CPT biosynthesis have been obtained, and promotors of some genes were also cloned. Further analysis showed that some bHLH transcript factors may involved in camptothecin biosynthesis and displayed similar trend of expression with these new genes. In this research, several molecular biology methods will be used to study the regulation mechanism of bHLH transcript factors in CPT biosynthesis pathway.

喜树碱类药物在临床上广泛用于癌症治疗，短小蛇根草作为一种产喜树碱的草本植物，具有生长快周期短，易于遗传转化等优势，是一种开展喜树碱生物合成的分子调控和代谢工程研究的优良材料。申请人在分析短小蛇根草差异转录组数据后，克隆获得17条喜树碱合成途径中关键酶基因，并进行基因启动子克隆和表达模式分析。进一步挖掘后筛选获得部分与关键酶基因表达趋势高度一致的bHLH转录因子。本项目拟利用分子生物学手段，对该bHLH转录因子在短小蛇根草中调控喜树碱合成的机制进行研究，以阐明并建立bHLH转录因子在短小蛇根草中参与喜树碱合成的调控网络。

短小蛇根草，全草含抗癌药物喜树碱（CPT）及其衍生物。喜树碱衍生类药物目前广泛应用于癌症临床治疗，但药源的短缺成为研发和应用喜树碱类化合物的巨大瓶颈。本研究通过对短小蛇根草转录组测序和基因工程，挖掘参与调控喜树碱生物合成的相关基因和bHLH转录因子，对其在喜树碱合成中的调控机制进行研究，分析了bHLH转录因子和喜树碱合成的关键酶基因的组织表达谱、生长周期表达规律、激素诱导响应特征，明确MYC转录因子与喜树碱合成途径中关键酶基因之间的调控关系，初步建立MYC转录因子在喜树碱合成中的调控网络，并获得了高产喜树碱的转基因材料。. 建立了紫外观测喜树碱的技术体系，研究了喜树碱在短小蛇根草中的分布，确认了喜树碱积累在叶片的栅栏组织，茎的木质部，根的周皮、维管束鞘和木质部细胞。优化了短小蛇根草中喜树碱的检测和提取方法。. 发现MYCL1和MYCL2过表达显著提高喜树碱的含量。酵母单杂交表明MYCL1和MYCL2 能够与关键酶SLS启动子中的G-box结合。推测MYCL1 和MYCL2 可能通过对关键酶SLS 的表达调控从而实现对喜树碱合成的调控。同时酵母双杂和BiFc实验结果显示MYCL1和MYCL2与JAZs 存在相互作用，可以确认JAZs具有对MYCL1和MYCL2基因表达的调控作用。可能MYCL1和MYCL2 与JAZs共同参与对外源甲基茉莉酸诱导的响应，并影响喜树碱合成下游SLS基因的表达，最终影响喜树碱的合成。.发现MYCL4和Op8HGO功能的缺失，明显改变喜树碱分布和减少喜树碱积累。MYCL4敲除株系中DLH,8HGO,SLS基因表达显著下调。确认MYCL4和8HGO在短小蛇根草喜树碱合成中具有重要的作用，MYCL4可能通过调控8HGO而影响喜树碱的合成。. 初步构建一个MYC家族参与喜树碱合成的调控网络：MYCs基因既可以通过对下游调控靶点，包括SLS, 8HGO等环烯醚萜途径基因的表达调控，从而影响喜树碱的合成。同时又受到上游OpJAZs的调控，响应甲基茉莉酸的诱导。MYC中不同成员具体调控靶基因的差异和甲基茉莉酸响应差异，也暗示它们在喜树碱合成途径中可能扮演着不同的角色。本研究为今后提高短小蛇根草中喜树碱含量提供科学依据，期望可以在将来为解决药源短缺提供一个新途径。