WRKY转录因子调控丹参酮生物合成的研究

WRKY转录因子是植物最大转录因子家族之一，参与植物生长发育、代谢调控及生物和非生物胁迫的防御。我们前期工作- - 丹参深测序结果，表明WRKY转录因子参与丹参酮生物合成，在生物信息学和基因表达谱分析基础上，RNA干扰转化毛状根，快速筛选出与丹参酮合成相关WRKY基因，且克隆到这两个WRKY基因。本研究在此基础上，采用实时定量PCR、Northern blotting、亚细胞定位等确定其时空表达模式；构建过表达载体和RNA干扰表达载体分别转化丹参或拟南芥，转录水平检测丹参酮合成关键酶基因的表达谱，同时检测脂溶性丹参酮含量的变化，以验证WRKY转录因子调控丹参酮生物合成；凝胶阻滞结合染色质免疫沉淀分析WRKY与DNA的结合活性，酵母双杂交结合免疫共沉淀分析WRKY互作蛋白，以确定WRKY转录因子的调控机制，进而阐明WRKY转录因子在调控丹参酮生物合成中的功能和机制。

丹参酮类化合物属于脂溶性二萜菲醌类化合物，是药用植物丹参的主要活性成分，目前对于丹参酮生物合成途径解析有突破性进展，但是对丹参酮生物合成的调控等研究甚少。实验室前期酵母提取物和银离子诱导丹参毛状根转录组分析，发现有15个WRKY转录因子的基因表达量明显升高，且与萜类骨架合成酶基因表达变化呈协同趋势。通过RT-PCR获得SmWRKY1基因cDNA的全长，大小为801bp，其分子量大小为29.64KD, 等电点pI为9.06。通过进化树分析和氨基酸序列比对发现，SmWRKY1属于Ⅱa类。利用QRT-PCR检测SmWRKY1在紫花丹参根、茎、叶、花中的表达情况，发现其在茎中的表达最高，而在花中基本检测不到该基因的表达。为了研究植物激素和非生物胁迫对SmWRKY1基因表达的影响，利用ABA、SA、MeJA、NaCl、甘露醇和乙烯利处理丹参，发现在不同的处理情况下，SmWRKY1基因的表达存在很大的差别，除了甘露醇和乙烯利处理，SmWRKY1基因的表达被抑制外，其它处理情况下，都呈明显的升高趋势。酵母双杂实验显示SmWRKY1有转录自激活的功能，属于转录因子家族。定位结果显示SmWRKY1与GFP融合蛋白的绿色荧光只能在细胞核内观察到，说明SmWRKY1定位于细胞核。原核表达显示该蛋白的大小约36KD，与预测一致。利用Gateway克隆技术构建SmWRKY1基因的过表达和干扰载体，转化丹参，通过显微鉴别、DNA水平的检测、RNA水平的检测鉴别出转基因阳性植株。以转基因丹参植株的根为材料，采用QRT-PCR检测与丹参酮生物合成相关酶基因的表达。结果显示在过表达转基因丹参株系中，MVA和 MEP途径中的限速酶基因以及丹参酮生物合成下游相关酶基因的表达都有明显的上升，而在干扰株系中，这些基因的表达呈现不同的变化趋势。在MVA途径中，HMGR1基因的表达变化不明显，但是HMGR2和HMGR3有较为明显的上升趋势，如HMGR3在Ri-3-9和Ri-5-12植株中的基因表达量分别是CK的17.5倍和5倍，而MEP途径中限速酶基因呈明显的下降趋势。在丹参酮生物合成下游相关键酶基因中，除IDI1外，其它基因的表达都有明显的抑制效果。上述的研究初步明确了SmWRKY1在丹参酮生物合成途径中起调控作用，并为后续进一步深入探讨其分子调控机制和挖掘新的基因奠定了重要基础。