甲基茉莉酸高效调控丹参酮生物合成的分子机理研究

心、脑血管疾病是威胁人类健康与生命的"头号杀手"。丹参酮是临床治疗心、脑血管疾病的重要药物资源；然而，丹参可用资源有限及有效成分含量低而使之应用受限。甲基茉莉酸(MJ)能显著提高丹参酮产量, 但丹参酮生物合成关键调控靶点及其调控机理尚不清楚。.本项目在优化丹参遗传转化体系和克隆丹参酮生物合成相关基因的基础上，拟应用荧光定量RT-PCR和HPLC等技术，分析MJ诱导前后丹参酮合成相关基因（HMGS，HMGR，DXS，DXR，GGPPS，AACT，CMK，FPS，IPPI，CPS，KS）表达与丹参酮积累的相关性，确定MJ调控丹参酮生物合成的关键酶基因，继而用丹参转基因方法确认关键酶基因在丹参酮生物合成中的作用；同时克隆关键酶基因上游调控序列，分析鉴定启动子的顺式作用元件和反式作用因子，以期揭示MJ调控丹参酮生物合成的分子机理，为今后提高丹参中丹参酮含量及缓解临床需求奠定基础和提供科学依据。

心、脑血管疾病是威胁人类健康与生命的“头号杀手”。丹参酮是临床治疗心、脑血管疾病的重要药物资源；然而，丹参可用资源有限及有效成分含量低而使之应用受限。甲基茉莉酸(MJ)能显著提高丹参酮产量,但丹参酮生物合成关键调控靶点及其调控机理尚不清楚。本项目优化了丹参遗传转化体系，并克隆了丹参酮生物合成相关基因（HMGS，HMGR，DXSI，DXSII，DXR，GGPPS），考察了MJ 诱导前后丹参酮合成相关基因表达与丹参酮积累的相关性，MJ对丹参毛状根中的丹参酮含量的影响明显，丹参酮含量最高（0.931mg/g），为对照组（0.161mg/g的5.78倍）。对GGPPS转基因毛状根（丹参酮产量为2.477mg/g）进行诱导后，在转基因（control）的基础上将丹参酮的含量又提高了3.19倍。丹参酮代谢合成途径中的大部分基因催化酶基因都在MJ处理后出现不同程度的表达上调，而SmHMGR, SmDXSII, SmGGPPS, SmKSL和 SmCPS 等基因的本底表达水平不高且这5个基因受到MJ的诱导而表达上调，推测SmHMGR, SmDXSII, SmGGPPS和SmCPS等可能是MJ调控丹参酮生物合成中的候选关键限速酶基因。.通过转基因手段验证了关键酶基因HMGR，DXSII，GGPPS和SmCPS在丹参酮的代谢合成中皆具有非常重要的作用，但是SmDXS、SmGGPPS和SmCPS的贡献更明显。组合利用SmDXS和SmGGPPS基因对于调控丹参酮的生物合成也具有显著的调控效果，同时对其他萜类物质如如环氧驱蛔萜、异薄荷酮、铁锈醇、豆甾醇和β-谷甾醇等物质的积累也具有促进作用，这为今后丹参遗传改良提供了参考依据。.同时克隆了关键酶基因（如HMGR,DXS 和GGPPS）的上游调控序列，分析鉴定了启动子的顺式作用元件和反式作用因子。通过构建丹参cDNA文库，诱导差异表达，酵母单杂交筛选，结合测序和生物信息学分析筛选等综合手段，成功克隆得到了多个MJ调控相关的全长转录因子基因（如SmJAZ3，SmJAZ9，SmWRKY3，SmWRKY54，SmWRKY70，SmO3-L1, SmO3-L2，SmERF等），并对部分转录因子基因进行了初步的功能鉴定和分析。以上研究结果较好地揭示了 MJ 调控丹参酮生物合成的分子机理，为今后提高丹参中丹参酮含量及缓解临床需求奠定基础和提供科学依据。