TRAIL和EGFR配体寡肽与力达霉素组成的双特异性强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤分子机制

2007年双靶点药物拉帕替尼的上市使多靶点抗肿瘤研究成为肿瘤靶向治疗的新方向。TRAIL是靶向性的生理活性物质，主要通过细胞外凋亡途径选择性地诱导肿瘤细胞凋亡；EGFR在许多上皮细胞癌中高表达，作为抗肿瘤研究的靶点被广泛关注，针对此靶点的抗肿瘤靶向药物已上市；力达霉素能通过细胞内凋亡途径引起肿瘤细胞凋亡，并强烈杀伤肿瘤细胞，可以作为导向药物的"高效弹头"。研究基础表明，力达霉素能通过DR5上调促进TRAIL引起的肿瘤细胞凋亡；文献资料证明，拮抗EGFR通路能加强肿瘤细胞对TRAIL的敏感性；而且我们已经制备有生物学功能的EGFR配体寡肽与力达霉素的融合蛋白。在此基础上，本研究利用TRAIL对肿瘤的选择性作用和EGFR配体寡肽的靶向作用以及力达霉素的凋亡诱导作用和高效抗肿瘤作用，构建sTRAIL和EGFR配体寡肽与力达霉素的全新的双特异性强化融合蛋白，并研究其体内外抗肿瘤作用及分子机制。

TRAIL与死亡受体(DR4，DR5)结合，通过细胞外凋亡途径选择性地诱导肿瘤细胞凋亡；EGFR异常表达是多种恶性肿瘤的共有特点；力达霉素（lidamycin, LDM）能通过上调DR5促进TRAIL引起的肿瘤细胞凋亡，拮抗EGFR通路能加强肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。本课题构建了Ec-LDP、LDP-TRAIL、Ec-LDP-TRAIL融合蛋白，并对其生物学活性进行了研究。Ec-LDP-TRAIL是我们研究的核心蛋白，也是本项目的研究内容。Ec-LDP-TRAIL在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达，产量为每升发酵液得到2 mg活性蛋白；Ec-LDP-TRAIL蛋白与高表达EGFR或DR4/DR5肿瘤细胞系A431或H460有很强的结合活性，而对表达EGFR和DR4/DR5很低的NIH/3T3细胞的亲和活性很弱。此外，双靶点特异性融合蛋白Ec-LDP-TRAIL还具有一定的抑制肿瘤细胞生长的活性；也可显著抑制人鳞状上皮细胞癌A431裸鼠移植瘤的生长。将Ec-LDP-TRAIL进行强化，得到强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE，它对A431、H460和NIH/3T3细胞系均表现出了强烈的杀伤作用。LDM和Ec-LDP-TRAIL-AE作用A431细胞后PARP的切割明显增强，产生了凋亡诱导作用。双特异性强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE在给药剂量为0.16mg/kg，给药一次的条件下，抑瘤率为70.75%，高于等剂量LDM的66.98%。总之，本研究成功构建并表达了具有TARIL和EGFR配体寡肽与力达霉素的双特异性融合蛋白Ec-LDP-TRAIL，该融合蛋白可特异地与肿瘤细胞表面的EGFR受体和DR4/DR5结合，并能抑制肿瘤细胞的增殖，在体内也能明显抑制裸鼠移植瘤的生长；经强化后的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对体外培养的肿瘤细胞具有强烈杀伤作用，能诱导肿瘤细胞凋亡，对人鳞状上皮细胞癌裸鼠移植瘤模型具有很强的生长抑制作用；强化与非强化的融合蛋白均具有较低的药物毒性，具有发展成肿瘤靶向性治疗药物的潜能。同时，本课题资助发表文章6篇（1篇为sci，5篇为核心期刊）、申请专利1项、培养研究生3名（其中1名已经毕业），参加国际会议1人次。