人源线粒体内膜转位因子Tim23和Tim50复合体结构与功能研究

近年来,线粒体在细胞中的作用越来越受到重视,细胞凋亡、老化以及多种疾病都与线粒体功能障碍或突变有关。98﹪的线粒体蛋白质是由细胞核编码、细胞质核糖体合成后转运到线粒体的。转运到线粒体基质的蛋白质需要通过线粒体外膜上的转位因子TOM40复合体后，与内膜上的转位因子TIM23复合体中的Tim23和Tim50的膜间隙结构域复合物结合后才能通过Tim23所形成的膜孔进入到线粒体基质。Tim23和Tim50在介导蛋白质转运过程中处于核心地位、发挥关键作用。本项研究将通过大规模生产人源Tim23和Tim50蛋白和其具有重要功能结构域片段以及突变体蛋白、生长蛋白复合物的晶体、解析蛋白复合物晶体的三维结构，阐明其三维结构与功能的关系，揭示TIM23复合体在蛋白质转运过程中的分子作用机制。该项研究成果对阐明线粒体疾病病理学机制、寻找疾病诊断的标志物、探索药物作用靶点等具有十分重要的意义。

本项目通过大量表达和纯化人源Tim23和Tim50蛋白和其具有重要功能结构域片段以及突变体蛋白, 来研究Tim23、Tim50 的结构特性和聚合程度，Tim23和Tim50 的相互作用及Tim23、Tim50和前导肽的相互作用，生长蛋白质晶体，解析蛋白质晶体的结构。揭示TIM23复合体的Tim23和Tim50蛋白在线粒体蛋白质转运过程中作用，阐明TIM23复合体转运线粒体蛋白的分子作用机制。本项研究基本上根据研究计划进行，取得了一定的预期研究成果。对项目的完成情况及取得成果做简单概述如下：.表达和纯化了人源Tim23和Tim50蛋白，制备了人源Tim23和Tim50的多克隆抗体，研究了人源Tim23和Tim50蛋白在细胞内的定位，用线粒体红和自备的抗体双染293T细胞确定了人源Tim23和Tim50蛋白也表达在线粒体上。筛选了Tim23和Tim50蛋白的重要功能结构域片段及其突变体，探索了这些蛋白的大量表达条件，在确定了目的蛋白既大量表达又有稳定结构的基础上，用多种方法尝试纯化了目的蛋白，成功地大量表达和纯化了Tim23、Tim50及其具有重要功能结构域片段以及突变体蛋白。研究了Tim23和Tim50蛋白的结构和聚合特性，发现了Tim50蛋白为单体且具有较稳定的结构，Tim23蛋白为二聚体且不折叠。研究了Tim23和Tim50的相互作用，发现了人源Tim23和Tim50不相互作用（到目前为止，国际上关于TIM23复合体蛋白的研究主要集中在酵母源上。大量的研究成果表明酵母源的Tim23和Tim50相互作用，且这种相互作用对输运前导蛋白进入线粒体具有至关重要的作用。），生长了蛋白质晶体，解析了蛋白质晶体的三维结构。分别研究了Tim23、Tim50和前导肽的相互作用，及前导肽对Tim23、Tim50结构的影响，发现了Tim23、Tim50和前导肽的相互作用主要是静电相互作用。揭示了TIM23复合体的Tim23和Tim50蛋白在线粒体蛋白质转运过程中的作用，阐明了TIM23复合体转运线粒体蛋白的分子作用机制。.在本课题的资助下，正式发表了7篇英文SCI论文，其中在Journal of Biological Chemistry发表了2篇、Journal of Physical Chemistry B发表了1篇，在中文核心期刊发表了3篇论文。申请了2项发明专利，其中一项已授