基于IRS-1 Tyr/Ser磷酸化失衡探讨芪地糖肾方干预糖尿病肾病足细胞自噬的机制

Podocyte impairment induced proteinuria is the critical influencing factor of Diabetic Nephropathy (DN) progression. For podocyte protecting, moderate autophagy is of great importance. Insulin receptor substrate 1 (IRS-1) plays a important role in insulin signaling transduction. The phosphorylation of its tyrosine residues (Tyr) can suppress autophagy via activating the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. Conversely, its serine residues (Ser) are confirmed to promote the autophagy by preventing the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway from activation. Thus, the balanced phosphorylation of IRS-1 Tyr/Ser contributes to moderate podocyte autophagy. Our previous studies have shown that Qi-Di-Tang-Shen formula can reduce proteinuria in DN patients and experimental rats, as well as alleviate podocyte impairment. Based on this, we presume that Qi-Di-Tang-Shen formula can regulate autophagy and reduce podocyte impairment by regaining the balance of IRS-1 Tyr/Ser phosphorylation and controlling downstream PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. To verify the above hypothesis, we in order to utilizing specific gene mutation knock-in and plasmid transfection to create unbalanced situation of IRS-1 Tyr/Ser phosphorylation. Our study can clarifying the podocyte protection mechanism of Qi-Di-Tang-Shen formula. And provide a new target for DN treatment of traditional Chinese medicing.

足细胞损伤导致的蛋白尿是糖尿病肾病(DN)进展的关键，适度自噬对足细胞保护至关重要。胰岛素受体底物1(IRS-1)酪氨酸(Tyr)或丝氨酸(Ser)磷酸残基化通过激活或抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，对自噬产生相反的作用。因此IRS-1Tyr/Ser磷酸化平衡在足细胞适度自噬中发挥重要作用。前期研究表明：芪地糖肾方可降低DN蛋白尿，减轻足细胞损伤。基于此我们提出芪地糖肾方通过恢复足细胞IRS-1Tyr/Ser磷酸化平衡，发挥调控细胞自噬，保护足细胞作用的假说。拟采用db/db自发2型DN小鼠和基因点突变阻断足细胞IRS-1Tyr或Ser磷酸化，模拟二者失衡状态，制备自噬激活或抑制细胞模型。从整体和细胞水平观察芪地糖肾方对IRS-1Tyr/Ser磷酸化平衡及其下游PI3K/Akt/mTOR信号通路和足细胞自噬的影响，以阐明芪地糖肾方足细胞保护作用机制，为临床防治DN蛋白尿提供新靶点。

足细胞损伤导致的蛋白尿是糖尿病肾病(DN)进展的关键，适度自噬对足细胞保护至关重要。胰岛素受体底物1(IRS-1)酪氨酸(Tyr)或丝氨酸(Ser)磷酸残基化通过激活或抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，对自噬产生相反的作用。因此IRS-1Tyr/Ser磷酸化平衡在足细胞适度自噬中发挥重要作用。前期研究表明：芪地糖肾方可降低DN蛋白尿，减轻足细胞损伤。基于此我们提出芪地糖肾方通过恢复足细胞IRS-1Tyr/Ser磷酸化平衡，发挥调控细胞自噬，保护足细胞作用的假说。采用db/db自发2型DN小鼠和基因点突变阻断足细胞IRS-1Tyr或Ser磷酸化，模拟二者失衡状态，制备自噬激活或抑制细胞模型。从小鼠肾脏组织和体外足细胞水平观察芪地糖肾方对IRS-1Tyr/Ser磷酸化平衡及其下游PI3K/Akt/mTOR信号通路和足细胞自噬的影响以阐明芪地糖肾方足细胞保护作用机制，为临床防治DN蛋白尿提供新靶点。第一、对水提物通过高效液相色谱联合质朴技术进行了成分分析，分析出药物成分的具体含量最高的78种药物成分，明确了芪地糖肾颗粒的具体作用成分，保证了实验结果的可重复性。第二、完成了并再次证实了芪地糖肾颗粒能够降低db/db小鼠尿蛋白水平，减轻肾脏病理改变，减轻肾小球滤过屏障损伤。并通过机制研究很可能与改善了长寿调节信号分子的的表达水平，从而改善了肾脏的自噬活性，减轻了线粒体损伤和肾脏纤维化。第三、为进一步分析芪地糖肾颗粒减轻肾脏损伤得内在机制，我们对肾脏内miRNA表达进行了测序分析，当前的初步分析结果支持芪地糖肾颗粒可能通过调控特异性miRNAs发挥了改善长寿调节通路的作用。第四、芪地糖肾方通过调节足细胞中IRS-1 Tyr/Ser磷酸化表达的平衡，影响其下游PI3K/Akt/mTOR信号通路而发挥调控足细胞自噬活性，保护足细胞，治疗DN蛋白尿的作用机制。