基于足细胞自噬探讨芒果苷防治糖尿病肾病的分子作用机制

Podocyte impairment is one of key pathophysiological processes during the occurrence and development of diabetic nephropathy (DN). It has currently been highlighted to screening for new drugs to treat DN based on the protection of podocyte. Recent reports found that autophagy might be essential to maintain the homeostasis and functions of podocytes, which might be altered in diabetic condition. Therefore the effective intervention of podocyte autophagy would be benificial to the prevention and treatment strategy for DN. Previous studies showed that mangiferin, a natural product from Mangifera indica L., has potential hypoglycemic activity and protective effect on kidney in diabetic animals. However, the protective effect mechanism of mangiferin remains unclear. Therefore, in the present study, the renoprotective effects of mangiferin, especially on podocytes, will be investigated in diabetic rats induced by streptozocin. Its molecular mechanisms underlying the autophagy pathway and upstream regulatory pathways will be investigated at the cellular and molecular level. The implementation of the investigation will offer the theoretical and experimental evidences for the application of mangiferin to treat DN.

肾脏足细胞受损是糖尿病肾病(DN)发生发展的关键病理生理过程，保护足细胞是目前寻找防治DN创新药物的研究热点。新近研究发现，自噬对于维持足细胞的正常结构和功能是必不可少的。因此有效干预足细胞自噬，将有利于防治DN。前期研究表明源于芒果叶的一种天然产物芒果苷具有较好的降糖活性，对糖尿病肾脏有一定的保护作用，但机制不明。据此，本研究将在前期研究基础上采用链脲霉素诱导形成DN大鼠，深入研究芒果苷对DN足细胞的保护作用，并采用基因转染、实时荧光定量PCR、Western Blot和电镜等技术在细胞和分子水平研究芒果苷对足细胞自噬通路及其上游调控信号通路关键靶点AMPK、mTOR 、LC3等的干预作用，探讨其作用机制，为芒果苷的深入研究和开发提供理论和实验依据，也为DN的防治策略提供新的理论依据。

目的：观察链脲佐菌素性糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞自噬的变化规律；基于自噬通路研究芒果苷对DN大鼠肾脏及足细胞的保护作用及机制。.方法：①复制糖尿病大鼠模型，观察5、10、15周DN大鼠足细胞自噬的变化。②研究芒果苷对DN大鼠的防治作用。检测24小时尿蛋白定量(24UP)、空腹血糖(FBG)、血尿素氮(SBUN)和血肌酐(Scr)水平，肾组织行病理检查、免疫荧光染色，电镜观察足细胞自噬体，WB检测肾nephrin、LC3等蛋白的表达。③体外培养小鼠肾足细胞或者大鼠系膜细胞，测定芒果苷对高糖损伤细胞活力的影响。WB检测细胞LC3等蛋白的表达；以荧光示踪法观察芒果苷对高糖条件下细胞自噬的影响。.结果：①5-15周模型组大鼠FBG、24UP、SBUN、Scr水平明显升高，肾小球体积增大、系膜基质明显增多，随病程延长肾脏损伤加重，nephrin蛋白表达逐渐减少。5周时DN大鼠肾皮质LC3-Ⅱ蛋白表达增强、p62蛋白表达减弱，LC3荧光增强，足细胞自噬小体增多；10和15周时LC3-Ⅱ蛋白表达减弱，p62蛋白表达增强，LC3荧光减弱，足细胞自噬体减少。②芒果苷可降低DN大鼠24UP、SBUN，还能改善DN大鼠的肾脏病理损伤；上调大鼠nephrin、LC3-II、p-AMPK、p-ULK1等蛋白，下调p62、p-mTOR蛋白。Nephrin/LC3免疫荧光双染色及电镜结果均显示芒果苷能增强足细胞自噬。③给予高糖，小鼠足细胞活力受抑制；芒果苷可增加高糖诱导下的足细胞活力，上调足细胞LC3-II/LC3-I、p-AMPK蛋白表达，降低p62、p-mTOR蛋白表达。给芒果苷后细胞GFP-LC3和MDC绿色点状荧光均增多。④芒果苷还能明显改善高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖，增强LC3-II蛋白表达和GFP-LC3绿色荧光。.结论：STZ诱导的DN大鼠足细胞自噬呈现先增强后抑制的动态变化。芒果苷能延缓DN的进展并具有足细胞保护作用，其机制与调节AMPK-mTOR-ULK1通路，增强足细胞自噬有关。芒果苷可改善高糖环境下小鼠足细胞和大鼠系膜细胞的活力，其机制可能是通过提高细胞自噬水平，从而维持细胞内环境的稳定，该作用有助于延缓糖尿病肾病的发生、发展。