通络益肾中药通过调控线粒体“自噬稳态失衡-凋亡”改善糖尿病肾病足细胞损伤的作用机制研究

Podocyte injury is the main cause of diabetic nephropathy (DN) proteinuria and end-stage renal failure. Mitophagy imbalance and the mediated pathway of apoptosis are the central link of podocyte injury. Repairing mitophagy and blocking podocyte apoptosis is a new target for DN treatment. Tongluo Yishen prescription is an effective treatment on DN,based on the "deficiency of healthyenergy and sthenia of evil", "kidney deficiency and stasis poisoning" chinese pathogenesis can protect renal function, inhibit podocyte apoptosis.But does it inhibit podocyte apoptosis by regulating mitophagy, protect mitochondrial function ?It is unclear. This project according to Tongluo Yishen prescription " strengthening healthy qi to eliminate pathogens " and " nourishing yin and tonifying yang , dispelling toxins and dredging collaterals " therapeutic methods , study podocytes cultured in vitro,choose different experimental observation points, observe the impact of Tongluo Yishen prescription and its nourishing yin and tonifying yang component, detoxification Tongluo component on mitophagy（SIRT1 /BN1P3、NLRP3 inflammatory bodies、ROS、P62、LC3II）,Mitochondrial apoptotic pathway protein（Bax、Bcl-2）and other indicators. To explore the multi-target effect of Tongluo Yishen prescription from mitophagy to inhibite podocyte apoptosis.At the same time enrich the scientific connotation of TCM theory of " strengthening healthy qi to eliminate pathogens ".

足细胞损伤是引起糖尿病肾病（DN）蛋白尿和终末期肾衰的主要原因，线粒体自噬稳态失衡及由此介导的凋亡是足细胞损伤的中心环节。修复线粒体自噬稳态，阻断线粒体凋亡途径是DN治疗的新靶点。基于“正虚邪实”“肾虚络瘀毒蕴”中医学病机的通络益肾方可保护肾功能，抑制足细胞凋亡。但其是否通过调控线粒体自噬稳态、保护线粒体功能而抑制足细胞凋亡？目前还不清楚。本项目根据通络益肾方“扶正祛邪”治则及“滋阴温阳，解毒通络”治法，以体外培养的足细胞为研究对象，选择不同实验终点，观察全方及滋阴温阳组、解毒通络组对线粒体自噬相关蛋白（SIRT1/BN1P3、NLRP3炎症小体、ROS、P62、LC3II）、线粒体凋亡蛋白（Bax、Bcl-2）的影响，探索通络益肾方从调控线粒体自噬稳态到抑制线粒体凋亡途径的多靶点足细胞保护作用。同时丰富中医“扶正祛邪”治则理论的科学内涵。

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是引起慢性肾衰竭的常见原因,足细胞损伤被认为是引起DN蛋白尿和肾小球硬化的中心环节。根据DN本虚标实的病机特点和在“肾虚络瘀毒蕴”理论指导下组建的临床经验方“通络益肾方”进行研究，直接针对虚、瘀、毒病机要点分为通络益肾方全方、滋阴温阳组、解毒通络组三组进行研究。以DN 足细胞线粒体自噬稳态失衡、线粒体功能障碍、足细胞凋亡的病理机制为切入点，探讨通络益肾方及滋阴温阳组、解毒通络组对该机制的调节作用。以高糖培养的足细胞为研究对象，观察全方及滋阴温阳组、解毒通络组对线粒体自噬相关蛋白（SIRT1、BN1P3、NLRP3、P62、LC3II）、线粒体凋亡蛋白（Bax、Bcl-2）、线粒体ROS、IL-1β、IL-18、足细胞凋亡等的影响，以阐明高糖培养不同时点线粒体自噬功能障碍、足细胞凋亡及相关调控蛋白的表达变化，探讨通络益肾方及其不同组分的干预作用及机制。结果表明：高糖环境下足细胞线粒体损伤严重，线粒体ROS表达持续升高，SIRT1、LC3Ⅱ蛋白及基因表达下调、BNIP3、NLRP3、P62蛋白及基因表达上调，促凋亡蛋白Bax表达持续升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达持续降低，炎症反应显著；足细胞凋亡呈时间依赖性加重。通络益肾方可改善线粒体损伤，增强线粒体自噬、抑制足细胞凋亡。其作用机制与上调SIRT1、LC3Ⅱ蛋白及mRNA的表达，下调BNIP3、NLRP3、P62蛋白及mRNA的表达，上调Bcl-2、下调Bax的表达，降低线粒体ROS含量，提高线粒体自噬水平、抑制炎症反应有关。依据其“滋阴温阳，解毒通络”之治法，对其拆方滋阴温阳组分及解毒通络组分进行研究，结果发现此两拆方均可增强线粒体自噬，抑制氧化应激及炎症反应，抑制足细胞凋亡；但滋阴温阳方在改善线粒体自噬方面优于解毒通络方，解毒通络方在抑制炎症反应、抑制氧化应激等方面优于滋阴温阳方，合方作用大于拆方作用。本研究探讨了通络益肾方延缓DN进展的作用及配伍机制，同时丰富了中医“扶正祛邪”治则理论的科学内涵。