饲料用多聚半乳糖醛酸酶的热稳定性机制及分子改良研究

Polygalacturonase is one of the most important feed enzymes that catalyzes the hydrolysis of the α-1,4-glycosidic bonds of pectic polysaccharide. Its wide use has been restricted by the thermolability during feed pelleting process. We previously obtained a polygalacturonase TePG1 that has higher specific activity and greater thermostability than most known counterparts, and resolved its crystal structure（1.5Å）. This enzyme thus represents an excellent experimental material for the study of thermostability mechanism. In this project, the key factors related to thermostability will be identified by using the rigidity theory-based thermal unfolding simulations of enzymes, combined with molecular evolution and conformation relationship between global and local structure rigidity. Site-directed mutagenesis will then be carried out to verify their effects on the catalytic performance and thermostability of TePG1. The results are of importance to clarify the thermostability mechanism of polygalacturonase and guide the thermostability improvement of feed polygalacturonase. The mutant enzymes with high specific activity and excellent thermostability will be manufactured for commercial purpose in feed industry.

多聚半乳糖醛酸酶能有效降解植物中的果胶多糖，是饲用酶制剂中的重要组成部分，但热稳定性一直是制约其在饲料中广泛应用的瓶颈。我们前期研究中获得了一个比活和热稳定性远高于其他同类酶的多聚半乳糖醛酸酶TePG1，并对其晶体结构进行了解析（1.5Å），从而为多聚半乳糖醛酸酶的热稳定性机制研究提供了绝佳的实验材料。本项目拟通过基于刚性理论的热诱导蛋白质解折叠过程动力学模拟计算，结合序列进化信息和整体与局部刚性结构上的架构关系，确定影响酶热稳定性的关键因子，进一步结合突变实验及功能研究对TePG1突变酶的性能进行验证。研究结果不但在阐明多聚半乳糖醛酸酶的热稳定性分子机制和指导饲料用多聚半乳糖醛酸酶的分子改良方面具有重要意义，而且改良的高比活、热稳定性良好的突变酶将直接应用于饲料工业，具有重要的市场价值。

热稳定性是工业酶的一个重要特性。糖苷水解酶第28家族的内多聚半乳糖醛酸酶有很多实际应用，但目前报道的结构信息较少，且其稳定性的机理尚不清楚。本项目中，我们筛选并获得了一个来源于嗜热真菌Talaromyces leycettanus JCM12802的内切多聚半乳糖醛酸酶TlPGA，该酶与其他GH28家族成员不同，TlPGA的最适温度为70℃，且催化活性非常高。对嗜热多聚半乳糖醛酸酶TlPGA的晶体结构解析后，并与目前已报道的所有同类酶结构进行比较分析，嗜热多聚半乳糖醛酸酶TlPGA显示出相对较大的暴露极性溶剂可接触表面积，这可能是TlPGA具有高热稳定性的独特特征。以此为突破口，通过定点突变技术针对嗜热多聚半乳糖醛酸酶TlPGA中潜在的蛋白表面极性氨基酸残基进行丙氨酸扫描，我们确定Thr284是一个关键位点。突变体T284A在熔融温度上与嗜热多聚半乳糖醛酸酶TlPGA相当，但其半衰期和半失活温度显著降低，表明残基Thr284参与了嗜热多聚半乳糖醛酸酶TlPGA的动力学稳定性。对嗜热多聚半乳糖醛酸酶TlPGA和突变体T284A的结构分析表明，Thr284的羟基和Gln255的Cα原子之间的碳氧氢键以及Gln255所采用的稳定构象有助于其动力学稳定性。项目研究结果阐明了GH28内切多聚半乳糖醛酸酶动力学稳定性的分子机制，并对工业应用中耐热酶的工程设计具有指导意义。在此基础上，利用计算机辅助设计技术对嗜热多聚半乳糖醛酸酶TlPGA的热稳定性进一步进行分子改造研究，所获得的突变体T316C/G344C其Tm值较野生型提高了10℃，且酶活性较野生型提高了36.5%（77931 ± 1282 U/mg vs 57,088 ± 559 U/mg）。经过对突变体T316C/G344C晶体结构进行解析，发现该突变体热稳定性提高的分子机理与二硫键完全不同，而是由于316和344位的半胱氨酸取代直接导致突变体T316C/G344C中Asn315和Thr343侧链的构象变化形成了一个氢键，同时，两个半胱氨酸的引入直接形成了新的烷基疏水相互作用，从而使得两个相邻β-折叠变得更稳定。在不影响酶活的前提下大幅度提高酶热稳定性的方法，无论对理论研究还是生产实践应用，都具有重要意义。