组织激肽释放酶对酸敏感离子通道介导的缺血缺氧损伤的影响及机制研究

虽然公认谷氨酸介导的Ca2＋毒性损伤机制是急性脑缺血再灌注损伤的主要环节，但临床试验却提示单纯谷氨酸受体拮抗剂没有显示有效的神经保护效能。新近，介导谷氨酸非依赖性Ca2＋毒性损伤的酸敏感离子通道（ASICs）在神经元损伤中起着重要作用。我们前期研究发现，组织型激肽释放酶（tissue kallikrein，TK）有肯定的神经保护作用，发现TK可通过ASCIs起到神经元保护效应，其机制不详，TK是通过抑制钙离子内流作用、还是直接对ASICs表达有影响？是通过信号通路、还是直接剪切离子通道？本项目拟对体外原代培养的缺血、缺氧、酸中毒神经细胞模型进行TK干预，利用膜片钳和Western技术观察TK对ASICs介导的损伤的影响，通过对神经元ASICs表达及其信号通路监测和通过转染细胞株及蛋白组学观察TK对ASICs的直接剪切作用初步探讨其深入的机制，以期发现TK神经保护的新靶点。

激肽释放酶-激肽系统（kallikrein-kinin system, KKS）是机体重要的炎性调节系统，广泛分布于人及其他哺乳动物的中枢神经系统内，在脑血管病、中枢神经系统变性、炎症、肿瘤等多种疾病中发挥作用。组织激肽释放酶（tissue kallikrein, TK）是KKS的重要组成部分，主要通过其效应物质缓激肽（bradykinin，BK）激活B1受体 （bradykinin B1 receptor, B1R）和B2受体（bradykinin B2 receptor, B2R）发挥病理生理作用。近年来越来越多的研究报道TK在脑缺血缺氧性损伤中起保护作用，但除了明确它的保护作用主要涉及到B2R及相关的信号通路外，其具体的神经保护机制并不清楚。目前认为脑缺血缺氧性损伤的核心是各种途径诱发的细胞内Ca2+超载。引起缺血缺氧损伤细胞内Ca2+超载的机制包括谷氨酸依赖的和酸敏感离子通道（acid sensing ion channels, ASICs）等介导的谷氨酸非依赖的Ca2+毒性损伤途径。那么，TK与缺血缺氧损伤中谷氨酸依赖的和非依赖的Ca2+ 毒性损伤机制的关系如何呢？本研究利用体外培养的大鼠皮层神经元，分别建立离体谷氨酸损伤模型、酸中毒、缺氧-酸中毒损伤模型，模拟在体缺血缺氧/再灌注过程, 分别观察TK对谷氨酸介导的神经毒性损伤和ASICs介导神经元毒性的影响，并初步探索其机制。组织激肽释放酶（TK），具有抗Glu神经毒性作用的特性，主要通过B2R,抑制Glu诱导的氧化/硝基化应激反应和凋亡、促进神经元存活。TK的作用与促进ERK1/2通路，尤其是ERK1，PI3K/Akt和NF-κB通路活化，抑制JNK通路活化有关。TK能够产生ASICs阻断剂类似的神经保护作用，能够减轻各种离体单纯酸中毒模型以及缺血-酸中毒再灌注模型对神经元的损伤，抑制神经元死亡、促进损伤神经元存活。TK的作用可能与增强ERK1/2信号通路激活、抑制JNK通路激活，以及抑制ASIC1a和促进ASIC2a蛋白表达有关。 总之，根据我们的研究结果，我们认为TK作为一种神经保护剂，在某种程度上，可能是通过影响Glu依赖的和非依赖的Ca2+神经毒性作用机制对缺血/缺氧性损伤产生保护效应的。