儿茶素类对晚期糖基化终末产物形成的抑制机制

晚期糖基化终末产物（AGEs）的形成是糖尿病肾病等慢性微血管并发症的关键发病因素。天然产物具有广泛的生物活性和毒副作用小的特点，还具有潜在的抑制AGEs形成的作用。本项目旨在研究天然产物儿茶素类对AGEs形成的抑制机制。以ADP-核糖或乙二醛糖基化组蛋白，研究儿茶素类抑制由非氧化途径产生羧甲基赖氨酸（CML）。以乙二醛或高浓度葡萄糖培养人肾小球系膜细胞和人脐静脉内皮细胞诱导生成AGEs，探讨儿茶素类对CML生成、氧化应激、羰基应激、脂质过氧化以及AGEs受体（RAGE）-mRNA表达的影响，阐明各途径对AGEs生成的抑制作用。建立大鼠蛋白糖基化模型和糖尿病模型，研究儿茶素类抑制体内AGEs的形成。项目探讨儿茶素类作用的途经有：⑴捕捉高度反应性羰基化合物的羰基；⑵抑制细胞氧化应激反应；⑶抑制脂质过氧化反应；⑷抑制Fenton反应。以上机制的研究为儿茶素类作为新药预防和治疗糖尿病并发症提供据。

葡萄糖在体内代谢产物乙二醛（GO）和甲基乙二醛（MGO）是活性二羰基化合物，可使蛋白发生非酶糖基化反应，形成可逆的Schiff base，最终发生美拉德反应形成晚期糖基化终产物（AGEs）。目前认为羧甲基赖氨酸（CML）和羧乙基赖氨酸（CEL）为GO和MGO主要形成的非荧光AGEs。本研究旨在探讨天然产物儿茶素类是否抑制无细胞模型下以及脐静脉内皮细胞的AGEs羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的形成。. 研究结果表明：Girard’s T 方法检测儿茶素类对GO或MGO的捕获能力的结果表明儿茶素对GO和MGO（1:1）抑制率分别为89.42%和80.73%，明显强于活性二羰基化合物捕获剂氨基胍（74.9%和76.82%）。从小牛胸腺提取出1.2 g组蛋白H1 用于无细胞组蛋白H1模型。DNPH方法检测发现，儿茶素有效抑制MGO诱导的Schiff base的形成。荧光法对荧光总AGEs 检测发现，200μM MGO明显增加组蛋白H1荧光物质生成量，儿茶素从摩尔分子比1:4时起明显抑制荧光物质生成量，1:1时抑制率可达到62.61%。Western blot结果表明100 μM -12 mM MGO 可使组蛋白H1成浓度梯度效应糖基化，蛋白表达降低，组蛋白H1 CML（34 KD和68 KD条带处）形成量增加。组蛋白SDS-PAGE电泳显示，随着MGO可增加68KD处蛋白表达量，而儿茶素孵育可进一步增加68KD处蛋白表达量。Western blot显示儿茶素可保护组蛋白H1不被400 μM MGO糖基化，当摩尔分子比为2:1时几乎完全保护，但在34 KD和68 KD条带处未显示出儿茶素减少CML的生成量。MTT法表明，24 h时，低于1mM MGO或GO对hy.926细胞和人脐静脉内皮细胞株（ECV304）无明显细胞毒性；（MGO）对ECV304和hy.926细胞的IC50为2 mM和3 mM。儿茶素可显著降低7 mM MGO的细胞毒性，氨基胍、半胱氨酸也可降低细胞毒性。叠氮化钠耗竭细胞的过氧化氢酶模型下，过氧化氢和ROS生成增多，但不改变细胞毒性。免疫荧光法检测发现MGO孵育EA. hy926细胞形成CEL，而儿茶素抑制甲基乙二醛诱导的CEL形成，儿茶素提前1h加入培养基孵育，能提高抑制率。