基于单细胞LBL技术构建3D缺氧微环境研究miRNA-382在糖尿病肾病系膜组织病变中的作用

Diabetic nephropathy is a kind of global prevalent chronic metabolic disease accompanying hypoxia, which develops and progresses pathologically basing on renal mesangial cell dysfunctions. Our former research demonstrated that miR-382 is crucial for maintaining of the normal physiological status of renal mesangial cells. Large quantities of studies revealed that miR-382 induced by hypoxia promotes angiogenesis via PTEN/Akt/mTOR signal pathway, while PTEN/Akt/mTOR signal pathway plays an important role in high glucose induced renal mesangial cell hypertrophy and matrix accumulation. Accordingly, we hypothesize that hypoxia could prompt renal mesangial cell hypertrophy and matrix accumulation via up-regulating miR-382 and activating PTEN/Akt/mTOR signal pathway. We intend to explore the influence of hypoxia microenvironment on miR-382 and PTEN/Akt/mTOR signal pathway by constructing three-dimensional hypoxia microenvironment via single cell layer-by-layer assembly technology established by the applicant’s team, investigate the correlation between renal mesangial dysfunctions and miR-382, clear the superposition effect of hypoxia microenvironment on high glucose induced renal mesangial cell hypertrophy and matrix accumulation, analyse the possible regulatory mechanism of miR-382 and its target gene, and further verify in experimental animals, hoping to provide new insight and therapy target of clinical prevention and treatment of diabetic nephropathy in efforts to retard the development and progression of diabetic nephropathy.

糖尿病肾病是全球高发的慢性缺氧代谢性疾病，而肾系膜细胞病变是其主要的病理基础。申请者前期研究发现miR-382对维持系膜细胞的生理状态至关重要。有证据表明：缺氧微环境能诱导miR-382表达上调，并通过PTEN/Akt/mTOR通路促进新生血管的形成；而PTEN/Akt/mTOR通路的激活在高糖诱导的系膜细胞肥大与基质增多病变中发挥重要作用。故有理由推测：缺氧微环境能上调miR-382，激活PTEN/Akt/mTOR通路并引发系膜组织的上述损伤。课题拟采用申请者前期建立的单细胞LBL技术，构建肾系膜细胞3D缺氧微环境，探讨缺氧微环镜对系膜细胞miR-382及PTEN/Akt/mTOR通路的影响；研究高糖诱导的系膜病变与miR-382之间的联系，并明确缺氧微环境对之的叠加效应；解析miR-382可能的调控机制及相关靶基因，并在实验动物中进行验证，以期为糖尿病肾病的临床防治提供新思路和新靶点。

糖尿病肾病（DN）是全球高发的慢性缺氧代谢性疾病，也是我国慢性肾衰竭的主要致病因素。DN的发病机制目前尚不完全明确，而肾系膜细胞病变是其主要的病理基础。我们既往研究发现，miR-382在肾系膜细胞的生理病理过程中扮演重要角色，而miR-382亦被证实与缺氧微环境有关，并通过PTEN/Akt/mTOR通路促进新生血管的形成。课题组采用单细胞纳米膜层层组装layer-by-layer(LBL)技术，成功构建了肾系膜细胞3D缺氧微环境，探讨了缺氧微环境与肾系膜细胞肥大及基质增生的相互关系，以及miR-382调控肾系膜细胞肥大及基质增生的机制。研究发现，缺氧微环境可诱导3D细胞球中miR-382表达显著上调，PTEN表达下调，而其TGF-β1和Fn表达显著升高，提示缺氧微环境可能通过上调miR-382水平引起肾纤维化，为体外研究缺氧微环境对肾纤维化的作用及其可能的机制提供了良好的实验模型。基于该LBL构建的肾系膜细胞3D培养体系，我们进一步研究发现，miR-382可能通过负向调控PTEN的表达，参与高糖所致肾系膜细胞肥大及细胞外基质增生过程，为糖尿病肾病临床诊治提供新靶点。在慢性肾脏病生物标志物研究方面，我们研究了PLA2R与膜性肾病临床表现及特点的关系，研究发现，在膜性肾病患者中，血清PLA2R抗体阳性而肾组织病理PLA2R阴性患者较双阳性患者临床与病理病变更趋严重。同时，课题组开展前瞻性队列研究，发现MMP-7与狼疮性肾炎病情活动密切相关，尿液MMP-7水平升高能更早的提示狼疮性肾炎病情活动。此外，课题组还拓展进行了人群研究，研究了糖尿病合并高血压患者出现蛋白尿的影响因素及临床转归，进一步探索研究了血压控制水平与慢性肾脏病进展及脑卒中的相关性。