基于大系统优化的CPC酰化酶的计算设计及实验验证

In this project, a systematic optimization based computational enzyme design model will be developed in terms of the preparation reaction of 7-ACA which is catalyzed by CPC acylase, and then an exclusive and efficient global optimization algorithm will be identified in order to solve the large scale mixed-integer linear programming problem which corresponds to the computational enzyme design model. Finally, the activities of the designed acylase mutants will be measured to validate the correctness of the proposed model for enzyme design, and the parameters in the model could be further improved by using the quantitative structure-activity relationship. Moreover, the flexibility of the enzyme template and a series of transition states during the reaction coordinate will be incorporated into the computational enzyme model and their effects on the sequence selection in active site will be studied and help to establish the fine relationship between sequence, structure, and function so as to discover the physio-chemical regulation which determined the unique amino-acid sequence in the enzyme active site. The potentially designed CPC acylase is promising to develop a one-step enzymatic green process for 7-ACA preparation, which is an crucial pharmaceutical intermediate for antibiotics production, and this process replacement just meets the urgent requirement of energy saving and emission reduction for the nation.

本申请以催化CPC水解制备7-ACA的反应过程为例研究建立计算酶设计的大系统优化模型，并开发求解该模型对应的大规模混合整数线性规划问题的全局优化算法，最后通过实验测定CPC酰化酶突变株的活性检验计算酶设计模型的正确性及对模型中的参数进行修正。本申请在具体的建模过程中将重点研究考虑蛋白质结构模板柔性对酶活性位点处氨基酸序列优化的影响，并将反应路径上酶与底物的一系列不同结合状态考虑进酶设计的模型中，通过模型分析及实验验证建立酶活性位点处的氨基酸序列、复合物结构及活性的定量关系，以此来分析决定酶活性位点处氨基酸序列的基本物理化学规律，为得到高效催化CPC水解反应的CPC酰化酶突变株打下理论基础。基于高效的CPC酰化酶突变株的一步酶法绿色工艺有望在制备医药中间体7－ACA的工业过程中取代现有的化学法及两步酶法，从而达到节能减排的目的，因此本申请在工业应用上也具有重要的推广价值。

本课题的背景是基于计算酶设计的方法创造人工酶催化剂从而开发以生物酶催化为主要手段的绿色工艺取代化学工业中给环境带来巨大污染的以化学催化为主要手段的传统工艺，本课题以设计头孢菌素酰化酶从而催化头孢菌素C水解制备药物中间体7-氨基头孢烷酸为具体的研究案例。具体的研究内容包括：（1）开发了基于拟牛顿法及界约束优化的关环算法，改善了催化残基匹配算法，可以安装多达10个催化残基及复杂约束的酶催化活性位点，为设计催化目的反应的人工酶催化剂打下基础；（2）开发了基于全原子模型及连续溶剂模型的氨基酸序列选择能量函数，这个函数包括范德华相互作用、疏水相互作用、氢键相互作用、基于普遍波恩模型的静电相互作用及熵作用，10个天然酶活性位点处的氨基酸序列84%可以复原，天然酶活性位点处的氢键网络可以准确预测；（3）建立了基于酶催化过渡态理论的氨基酸序列选择全局优化算法，该算法基于末端消除法、大规模线性规划及混合整数线性规划，可以求解计算复杂性达到10100的蛋白质设计问题；（4）开发了用于过滤计算酶设计中得到的大量氨基酸序列的分子动力学模拟方法，模拟结果表明大量假阳性的设计结果可以被有效剔除；（5）以具有低活性的天然假单胞菌N176头孢菌素C酰化酶为模板设计了稳定性大大提高的突变体，最好的突变体其蛋白融化温度提高了11.7度。在稳定性提高的基础上引入新的突变得到了催化效率很大提高的突变体，在实际工业合成测试条件下本课题设计的突变体的催化效率要远高于文献报道的结果。本课题开发的计算酶设计的研究方法可以用来设计催化头孢菌素C水解反应以外的其它化学反应的酶催化剂，进而开发制备高附加值化学品的绿色工艺，实现化学工业循环发展的要求，为解决我国目前面临的严重的环境危机带来机遇。